重组蛋白纯化资料

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。 分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩G

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化

（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机

2. 方法

2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20m

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

第31卷 第2期2011年2月

北京理工大学学报

TransactionsofBeiinnstituteofTechnolojgIgy

Vol.31 No.2Feb.2011

GST和His标记的重组蛋白制备及

吸附纳米ZnO的研究

()北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029

()摘 要:以p载体为模板人工设计引物,通过P序ET-28a+)CR反应扩增带有质粒上游6聚组氨酸(6×Histidine,列的目的基因片段,克隆到原核表达载体p筛选及鉴定阳性重组子p转化E.GEX-4T-3中,GEX-HiscoliBL21细胞后通过I和6聚组氨酸标记的重组蛋白G利用NPTG诱导表达.由谷胱甘肽(GST)ST-His得到表达,iNTA系-通过蛋白结合纳米无机材料的亲和吸附实验结果证实,重组的新蛋白表现出对纳米ZnO特异吸附的生物活性.关键词:谷胱甘肽;6聚组氨酸;基因重组;蛋白表达与纯化;亲和吸附

()中图分类号:Q819 文献标志码:A 文章编号:1001-0645201102-0240-04

/统进行纯化.通过S由LDS-PAGE电泳和Westernblot分析鉴定,C-MSMS质谱分析确定所得蛋白为目标产物.

宋磊, 陈劲春

Preara

蛋白质纯化

一．可溶性蛋白的纯化

方法 AC IEX GF 粗分离 + + - 中度纯化 + + - 精细纯化 - + + 1. 盐析

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。

2. 亲和纯化

Tag His GST MBP Strep(II) Flag

Size (aa) 6 218 396 8 8 Capacity (mg/ml) 40 10 10 6 0.6 MW (kDa) 1 26 42.5 1 1 Cleavage TEV/ Thrombin Thr

为了获得细粒棘球绦虫66ku抗原的重组蛋白和抗血清,用该抗原的cDNA克隆EgA31构建了pQE30-EgA31重组质粒,在大肠埃希氏菌M15中表达,经亲和层析获得纯度较高的EgA31重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得EgA31重组蛋白抗血清。本文就重组蛋白的稳定性和复性处理中遇到的问题进行了讨论。

维普资讯

中匡兽医科技

第3 2卷

第 l期

20 0 2年

细粒棘球绦虫 e A克隆 E A 1在大肠埃希氏菌 M1 DN g3 5中的表达及重组蛋白的纯化和复性傅玉才，王进成，张壮志。,季( .汕头大学医学院，东汕头 1广

or sBo q e雄。 AF e Fr nc ie Pe a y wl— a o s t v,Ge ge s u t.

5 5 3;2新疆畜牧科学院兽医研究所 .疆乌鲁术齐 10 1 新

800￣ 30 06 57 ) 9 3 3

3 .新疆地方病防治研究所，新疆乌鲁术齐 8 0 0}4法国里昂第一大学，法国里昂 302

摘要：为了获得细粒棘球绦虫 6 u抗原的重蛆蛋白和抗血清 .该抗原的 e A克隆 E A 1构建了 p 3 6k月 DN g3 QE 0一 E A 1重组质粒，太肠埃希氏茵 M1 g3在 5中表达，经

为了获得细粒棘球绦虫66ku抗原的重组蛋白和抗血清,用该抗原的cDNA克隆EgA31构建了pQE30-EgA31重组质粒,在大肠埃希氏菌M15中表达,经亲和层析获得纯度较高的EgA31重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得EgA31重组蛋白抗血清。本文就重组蛋白的稳定性和复性处理中遇到的问题进行了讨论。

维普资讯

中匡兽医科技

第3 2卷

第 l期

20 0 2年

细粒棘球绦虫 e A克隆 E A 1在大肠埃希氏菌 M1 DN g3 5中的表达及重组蛋白的纯化和复性傅玉才，王进成，张壮志。,季( .汕头大学医学院，东汕头 1广

or sBo q e雄。 AF e Fr nc ie Pe a y wl— a o s t v,Ge ge s u t.

5 5 3;2新疆畜牧科学院兽医研究所 .疆乌鲁术齐 10 1 新

800￣ 30 06 57 ) 9 3 3

3 .新疆地方病防治研究所，新疆乌鲁术齐 8 0 0}4法国里昂第一大学，法国里昂 302

摘要：为了获得细粒棘球绦虫 6 u抗原的重蛆蛋白和抗血清 .该抗原的 e A克隆 E A 1构建了 p 3 6k月 DN g3 QE 0一 E A 1重组质粒，太肠埃希氏茵 M1 g3在 5中表达，经