分离胞外蛋白酶株的培养基

一株高产胞外蛋白酶菌株的选育

摘要：本实验采用的菌株来源于XXX大学动科院养牛场中的土壤，通过设置不同的培养基来筛选具有产胞

外蛋白酶能力的菌株。以酪素培养基平板产生的透明圈的直径/菌落直径的大小作为选择标记，经初筛选择出比值大的菌株为出发菌株。经紫外线诱变处理，培养获得两种未知高产胞外蛋白酶菌株。对其进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明突变菌株w1的形态、生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，而突变菌株w2为革兰氏阴性杆菌。

关键字：细菌；胞外蛋白酶；筛选 ；鉴定

蛋白酶（Protease）是催化蛋白质水解的一类酶，微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。该酶催化反应速度较快，无工业污染，且反应条件适应性宽，被广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。目前微生物菌种选育所采用的诱变手段主要有激光诱变、DES诱变结合热处理、空间诱变、紫外线照射和亚硝基胍复合诱变等。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。常见的能产生蛋白酶的蛋白微生物有细菌中的

２００９年１９（２）

生物技术５１

用酪蛋白平板初筛和发酵脱胶复筛对脱胶细菌进行筛选，有效地缩小了目的菌的筛选范围，得到了一株可明显降低原料残胶率的细菌Ｄ７，处理后原料残胶率将为５．１２％。我们又对其个体形态与菌落形态、生理生化特征１６ＳｒＤＮＡ序列进行了分析，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Ｄ７进行分类鉴定。结果表明菌株所为芽孢杆菌，

［４］张海霞．绢纺原料的微生物脱胶处理技术［Ｄ］．上海：东华大学硕士学位论文，２００５：１３．

【５］李志忠，蒋少军．蚕丝蛋白酶精练工艺的理论与实践【Ｊ］．染整技术，２００６．２８（４）：１３—１５．

［６］中国纺织大学绢纺教研室．绢纺学（上册）［Ｍ］．北京：纺织工业出版

社，１９８５：１０７—１０８．

［７］ＲＥ布坎南，ＮＥ吉本斯．中圃科学院微生物研究所＜伯杰氏细菌签定手册）翻译组译．伯杰氏细菌鉴定手册［Ｍ］．３版．北京：科学出版社。

１９８４．

与腊样芽孢杆菌（励诎岱删）的同源性最高，属于腊样芽孢

杆菌类。所最适生长温度３７℃左右，最适生长ｐＨ６。５—７。５，可根据菌株Ｄ７生长的环境条件设定发酵工艺参数。该脱胶菌的获得为研究蚕丝微生物纯种发酵脱胶奠定基础。

参考文献：

［１］萤炳荣．绢纺织［Ｍ］．北京：

２００９年１９（２）

生物技术５１

用酪蛋白平板初筛和发酵脱胶复筛对脱胶细菌进行筛选，有效地缩小了目的菌的筛选范围，得到了一株可明显降低原料残胶率的细菌Ｄ７，处理后原料残胶率将为５．１２％。我们又对其个体形态与菌落形态、生理生化特征１６ＳｒＤＮＡ序列进行了分析，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Ｄ７进行分类鉴定。结果表明菌株所为芽孢杆菌，

［４］张海霞．绢纺原料的微生物脱胶处理技术［Ｄ］．上海：东华大学硕士学位论文，２００５：１３．

【５］李志忠，蒋少军．蚕丝蛋白酶精练工艺的理论与实践【Ｊ］．染整技术，２００６．２８（４）：１３—１５．

［６］中国纺织大学绢纺教研室．绢纺学（上册）［Ｍ］．北京：纺织工业出版

社，１９８５：１０７—１０８．

［７］ＲＥ布坎南，ＮＥ吉本斯．中圃科学院微生物研究所＜伯杰氏细菌签定手册）翻译组译．伯杰氏细菌鉴定手册［Ｍ］．３版．北京：科学出版社。

１９８４．

与腊样芽孢杆菌（励诎岱删）的同源性最高，属于腊样芽孢

杆菌类。所最适生长温度３７℃左右，最适生长ｐＨ６。５—７。５，可根据菌株Ｄ７生长的环境条件设定发酵工艺参数。该脱胶菌的获得为研究蚕丝微生物纯种发酵脱胶奠定基础。

参考文献：

［１］萤炳荣．绢纺织［Ｍ］．北京：

枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶液体发酵培养基优化及条件的研究

摘要：通过单因素实验在摇瓶条件下对枯草芽胞杆菌产碱性蛋白酶的液体培养基进行优化，确定了最佳碳源为糊精。进一步在5L的发酵罐上进行发酵并对发酵过程进行控制得到以下结论：枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶为生长相关型发酵类型，生长周期为38h，发酵到36h时酶活达到最大 ，酶活最大值为433U/mL，此时pH为8.35，OD600为1.158。可以用pH是否超过8来当作发酵终点的表观特征。

关键词：枯草芽孢杆菌 液体发酵 培养基优化 发酵条件

引言：碱性蛋白酶(Alkaline protease) 广泛存在于微生物中,最早发现在猪的胰脏中[1 ] ，1913 年Rhom 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945 年瑞士的Dr. J agg 等发现了微生物碱性蛋白酶，使其成为洗涤剂的主要添加剂之一。碱性蛋白酶在丝绸、制革工业、饲料工业、动物食品加工中也有广泛用途，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于CGM(玉米渣) 的水解，以制取玉米肽饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。枯草芽孢杆

蛋白酶酶切位点

蛋白酶的分类及作用位点 蛋白酶 氨基肽酶 菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 分类 金属蛋白酶 巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 作用位点 已知抑制物 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉 不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键 无特异性 α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；EDTA，EGTA 不能分解R、P或羟脯氨酸 K- Lys，R- Arg羧基端 氨基酸羧基端 EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 组织蛋白酶C 琉基蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 胶原酶 dispase 金属蛋白酶 金属蛋白酶 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基醋酸碘， 甲醛 端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R- Arg之后 在E- Glu/Gln或D- Asp之后 在K- Lys之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R- Arg之后 无特异性 在一些R- Arg之后 抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白 EDTA,EGTA,还原剂,但无血清

蛋白酶酶切位点

蛋白酶的分类及作用位点 蛋白酶 氨基肽酶 菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 分类 金属蛋白酶 巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 作用位点 已知抑制物 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉 不分解由X-Pro、D或Q组成的肽键 无特异性 α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 带有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；EDTA，EGTA 不能分解R、P或羟脯氨酸 K- Lys，R- Arg羧基端 氨基酸羧基端 EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 组织蛋白酶C 琉基蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 胶原酶 dispase 金属蛋白酶 金属蛋白酶 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基醋酸碘， 甲醛 端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F- Phe,T- Thr或Y- Tyr之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R- Arg之后 在E- Glu/Gln或D- Asp之后 在K- Lys之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R- Arg之后 无特异性 在一些R- Arg之后 抑肽酶,PMSF,TPCK,α-巨球蛋白 EDTA,EGTA,还原剂,但无血清

温度对木瓜蛋白酶活性的影响

实验目的

1.1 掌握蛋白酶活性的测定方法

1.2 理解酶促反应的最佳温度、酶的热稳定性 1.3 了解蛋白酶的催化反应机理

2 实验原理

酶既具备一般非生物催化剂的加快反应速度的功能，又具有一般催化剂所不具备的生物大分子的特征。

酶与一般非生物催化剂相比，具有以下几个特点：

a.酶的主要成分是蛋白质。b.酶促反应所需的活化能较低。c.酶的催化效率非常高。d.酶具有高度的专一性。

影响酶作用的因素有酶的浓度、底物浓度、pH、温度、激活剂及抑制剂等。

木瓜蛋白酶属于中性蛋白酶，它的催化作用受温度的影响较大。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。另外，酶的热稳定性也是酶性质研究的重要内容。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显的改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性，但不能使酶失活。

木瓜蛋白酶是一种具有广泛底物专一性的巯基类蛋白酶。有很强的分解蛋白质的能力，此外还具有水解酰胺键和酯键的特性。由于它具有适用pH范围广，热稳定性好等优点，广泛应用于食品，工业，医药生产中。

位于木瓜蛋白酶

菠萝蛋白酶提取

一． 实验目的:

1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性； 2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。

二．实验原理：

菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。 在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。 高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。 有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。 本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

蛋白酶产生菌的筛选

组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：***

一、实验目的

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容

蛋白酶产生菌的分离

三、实验原理

许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

四、实验材料和用具

1.材料：土壤样品

2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL

无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、

3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇

床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

五、操作步骤

（一） 配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，

琼脂 1.5～

枯燥芽孢杆菌培养条件的优化及蛋白酶的测定 1 材料

1.1菌种：

菌株: 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis，由生化实验室提供。

1.2培养基

斜面培养基:牛肉膏3 g，蛋白胨1g, NaCl 5g，琼脂1.5g-2.5g,pH7.2-7.4 配置100ml。 种子培养基： 蛋白胨 1 % ,酵母浸出物 0. 5 % ,氯化钠 1 % ,自然 pH。 液体发酵培养基：葡萄糖15g/L，酵母浸出物5g/L,MgSO4 5g/L,pH 7. 0 。

1.3 主要仪器 ：

电热恒温鼓风干燥箱 ,高压蒸汽灭菌锅, 高性能无菌实验, LDZ4 -0.8A 离心机, 分光光度计, 生化培养箱HPS-250, 细菌漏斗(No4～5), 玻璃层析柱(20 mL)，梯度混合器，蛋白检测仪，记录仪，部分收集器，接收试管、天平，酸度计等。

1.4主要试剂 ：

蛋白胨 牛肉膏 NaCl H2PO4 NaOH KCl Na2CO3 Na2HPO4 NaH2PO4 Li2SO4 NH4HCO4 HCl (NH4)2SO4 、 ZnCl2 CuSO4 DEAE-Sep