WB试剂配方

WB试剂配方

SDS-上样缓冲液(2X) 100ml （100 mM Tris-Cl (pH 6.8)；4% (w/v) SDS；0.2% (w/v) bromophenol blue；20% (v/v) glycerol；200mM DTT (dithiothreitol) Tris-base 1.2114g

SDS 4g bromophenol blue 0.2g glycerol 20ml

ddH2O 定容至80ml 1M DTT 20ml

Store the SDS gel-loading buffer without DTT at room temperature. Add DTT from a 1 M stock just before the buffer is used.

配胶：

30%丙烯酰胺（商品化29:1） Tris-HCl：

（1）分离胶（PH8.8）1.5M

称取Tris-base（MW121.14）91.855

WB试剂配方

SDS-上样缓冲液(2X) 100ml （100 mM Tris-Cl (pH 6.8)；4% (w/v) SDS；0.2% (w/v) bromophenol blue；20% (v/v) glycerol；200mM DTT (dithiothreitol) Tris-base 1.2114g

SDS 4g bromophenol blue 0.2g glycerol 20ml

ddH2O 定容至80ml 1M DTT 20ml

Store the SDS gel-loading buffer without DTT at room temperature. Add DTT from a 1 M stock just before the buffer is used.

配胶：

30%丙烯酰胺（商品化29:1） Tris-HCl：

（1）分离胶（PH8.8）1.5M

称取Tris-base（MW121.14）91.855

Western blot 步骤： 配胶 制胶 跑胶

转移胶（转膜）

封闭和孵抗体 扫膜

一.配胶

这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度） 2.浓缩胶

均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）

PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存

Western Blotting试验步骤

一， 组织蛋白提取

1. 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。

注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。

2. 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。

注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。

3. 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 二， 提取液中总蛋白的测定

用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。

1. 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体

积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小

WB步骤

WB仪器和试剂：

ELX800uv酶标仪（Bio-TEK公司） 电泳槽（Amersham Biscience公司） 转移槽（Amersham Biscience公司）

ECL发光试剂盒（Thermo公司） SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（Beyotime） 硝酸纤维化膜（Pall Corporation） 抗体（艾博抗（上海）贸易有限公司） SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Beyotime） PBS（厂家：ORIGENE 批号：150309） 显影液(天津市汉中摄影材料厂) 定影液(天津市汉中摄影材料厂)

BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime） Western 一抗二抗去除液（Beyotime） 低温高速离心机（Eppendorf）

小鼠抗β-Actin单抗（MouseAnti—beta ActinMonoclonal Antibody） 辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（Perxidase—Conjugated Affinipure Goat Anti—RabbitIgG(H+L)）

PageRulerTMPrestained Protein Ladder（Thermo公司）

Anti—P Glycoprotei

WB 实验步骤

1. 蛋白提取，吸出培养基，用适量DPBS清洗，吸出DPBS，尽量吸干净，加入适量细胞裂解液，冰上裂解15-30min

2. 用细胞刮刀刮取皿或瓶底部的细胞，收集至1.5ml的离心管中，12000rpm离心，4度，15-30min将上清转移到新的离心管中 3. 检测蛋白浓度，定量（20-40ug），用水和蛋白上样缓冲液配成30ul以内的体积，100度变性10min，冷却后离心，上样

4. 将胶装在电泳槽内，加入1x电泳缓冲液到指定刻度，拔出梳子用注射器清洗胶孔，上样 5. 60V电压压缩蛋白至同一位置（分离胶与浓缩胶交界处），130V分离蛋白。配置转膜缓冲液，并将膜浸泡其中，4度预冷

6. 待蓝色的缓冲液条带到达距离胶底面0.5cm处即可开始转膜，按照从负极到正极海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序组装，避免产生气泡，对应正负极放入转膜槽

7. 低温转膜90min，丽春红染色，初步判定WB效果，并在对应位置将目的条带剪下来 8. 用5%的脱脂牛奶封闭，室温1小时以上，用特定的一抗4度过夜 9. 清洗一抗，用适量的TBST，室温3次，每次10min

10. 加入对应的二抗，室温孵育1小时以上，并清洗3次，同9 11. 按1:1的

Thursday, 26st June 2013

REAGENT SOLUTIONS

The vessels used for the preparation of the reagents must be as clean as possible, preferably made of Teflon, PE or PP materials. The best is to use the vessels always for storing and preparation of the same solutions, avoiding so cross-contamination.用于制备试剂的容器应该尽可能的干净，最好用聚四氟乙烯，聚乙烯或聚丙烯材料。最好同一个容器装同一个试剂，以避免交叉感染。

If used vessels are applied, clean the vessels 3 times with Potable water, 3 times with 0.01M Nitric acid (HNO3) and 3 times with Demineralized water.如果容器已经使用过，最好用饮用水清洗三次，用0.0

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理

1． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯

WB实验步骤

1. 组织样品制备

⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。

⑵裂解后，将裂解液移1.5ml 离心管中，（若有组织残渣可继续冰上振荡30min）；然后4℃、12000rpm离心20min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20 ℃保存（-80℃长期保存）。12000g离心，4℃，2min。

⑶取少量上清进行定量。

⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。 2. 蛋白定量

2.2.1制作标准曲线

（1）从－20℃取出浓度为1μg/μl的BSA（牛血清白蛋白，蛋白标准品），室温融化后，备用，使各个孔的终体积为20ul。 BSA浓度（μg/μl） 0 BSA(μl) PBS(μl) BSA含量(μg) 0 20 0 0.025 1 19 0.5 0.050 2 18 1 0.100 4 16 2 0.200 8 12 4 0.300 12 8 6 0

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

↓

制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

↓

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷

4.电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（