岛津高效液相色谱工作站

1.目的：规范高效液相色谱工作站数据管理。 2.范围：质量研究部 3.内容：

3.1 根据《药品数据管理规范》及waters Empower工作站软件使用说明书制定本规程。

3.2系统策略设置

3.2.1系统策略是整个工作站合规性设置的基础，由管理员进行设置，其他项目相关设置不得与系统策略设置相违背。 3.2.2用户：

强制使用唯一用户名；强制使用唯一用户密码；限制尝试登录次数为5次；强制使用最小密码长度4字符。

不允许多重登录。 全局缺省用户界面：pro。 3.2.3新建项目：

支持全面审计追踪。

项目对象注释：无限制，全部确认身份。 不允许用户更改支持全面审计追踪设定。 不允许用户从非FAT项目复制到FAT项目。 3.2.4系统审计追踪策略：

系统对象 项目 节点 系统 库 用户 用户组 用户类型 样品板类型 系统审计追踪 离线系统审计追踪 项目/样品档案 离线项目/样品档案 缺省字符串 数据库属性 注释 无限制 安静 安静 无限制 无限制 安静 安静 安静 无限制 无限制 安静 安静 安静 安静 确认身份 √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 自动归档属性 系统策略 SDMS存档属性 ECord 安静 安静 安静 安静 √ √

岛津DAD高效液相色谱操作规程

1、 用途：进行样品纯度和杂质的分析，可以满足全波长采集数据并进行最佳

吸收波长的选择。

2、 系统组成：本系统由2个LC-20ATvp溶剂输送泵, 7725i手动进样阀，

SPD-M20A紫外-可见检测器、岛津原装色谱数据工作站和电脑

等组成，柱温箱、不间断电源等辅助设备。

3、 准备

3.1 准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤（水相用水膜，有机相用

有机膜），超声脱气20min。

3.2根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（注意方向，顺序是从进样器流经 色谱柱进入检测器方向，色谱柱箭头方向为流速方向）。 3.3倒掉废液瓶中的废液。

3.4检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。 4、 操作规程 4.1启动仪器：

4.1.1首先打开柱温箱并设置柱温箱温度为40℃按柱温箱控制界面上的

ready键启动柱温箱。

4.1.2 依次开启电脑、按power键开启检测器和泵控开关。 4.1.3 将泵A、泵B吸滤器相应的放入到准备好的流动相中。 4.1.4 逆时针转动泵的排液阀180°，打开排液阀

4.1.5 按泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速

岛津DAD高效液相色谱操作规程

1、 用途：进行样品纯度和杂质的分析，可以满足全波长采集数据并进行最佳

吸收波长的选择。

2、 系统组成：本系统由2个LC-20ATvp溶剂输送泵, 7725i手动进样阀，

SPD-M20A紫外-可见检测器、岛津原装色谱数据工作站和电脑

等组成，柱温箱、不间断电源等辅助设备。

3、 准备

3.1 准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤（水相用水膜，有机相用

有机膜），超声脱气20min。

3.2根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（注意方向，顺序是从进样器流经 色谱柱进入检测器方向，色谱柱箭头方向为流速方向）。 3.3倒掉废液瓶中的废液。

3.4检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。 4、 操作规程 4.1启动仪器：

4.1.1首先打开柱温箱并设置柱温箱温度为40℃按柱温箱控制界面上的

ready键启动柱温箱。

4.1.2 依次开启电脑、按power键开启检测器和泵控开关。 4.1.3 将泵A、泵B吸滤器相应的放入到准备好的流动相中。 4.1.4 逆时针转动泵的排液阀180°，打开排液阀

4.1.5 按泵的[purge]键，pump指示灯亮，泵大约以9.9ml/min的流速

1、高效液相色谱 仪器设备名称 高效液相色谱仪 数量 1 技术指标四元梯度输液泵：工作模式：相互独立、电子控制的双柱塞直线驱动装 置，双压力传感器反馈回路，无需混合器和阻尼器。溶剂数：1—4。 流速范围：0.010—10.000ml/min, 以 0.001ml/min 为增量。流速精度： ≤0.075%RSD，流速准确度：±1.0%。操作压力：0—5000psi。混合范围： 0.0—100.0% 以 0.1% 增量。梯度曲线：多种梯度曲线，线性、步进、 凸线和凹线。 光电二极管阵列检测器：波长扫描范围：190～800nm。光源：全程氘灯 （190～800nm），不用钨灯。波长准确度：±1nm。测量范围：0.0001～ 2.0000AUFS，可以设定波长范围扫描检测或者定点波长检测。 荧光检测器（2475型）：灯：150W 氙灯，连续弧光。检测限：水的拉 曼光谱 ≥ 1000，激发波长：200—890nm，发射波长：210—900nm， 波长重现性：±0.25nm，波长准确度：±3nm。 色谱软件：原版软件。 仪器组成：四元泵、手动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、荧光检 测器、C18色谱柱、保护柱、原装软件、其它设备运行必须品。

高效液相色谱原理

1、概述

在所有色谱技术中，液相色谱法（liquid chromatography，LC）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。

气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。

2、液相色谱流程图 1、储液罐；2输液泵；3、进样器；4、色谱柱； 5、检测器；6、工作站；7废液灌

3、原理

液相色谱根

一般情况下，HPLC分离方法的建立遵循以下步骤：

(1)了解样品的基本情况

所谓样品的基本情况，主要包括样品所含化合物的数目、种类(官能团)、分子量、pKa 值、UV光谱图以及样品基体的性质(溶剂、填充物等)、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。

(2)明确分离目的

①是分析组分还是制备样品；

②是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需做定性分析；

③是否有必要解析出样品的所有成分(比如对映体、非对映体、同系物、痕量杂质)；

④如需做定量分析，精密度需多高；

⑤建立的方法将适用几种样品分析还是许多种样品分析；

⑥将使用最终方法的常规实验室中已有哪些HPLC设备和技术。

(3)了解样品的性质和需要的预处理

除非样品是适于直接进样的溶液，否则，高效液相色谱分离前均需进行某种形式的预处理。有的样品需加入缓冲溶液以调节pH值；有的样品含有干扰物质或“损柱剂”而必须将其去除。此外，为了保证最终的样品溶液与流动相的成分尽量相近，最好用流动相溶解(或稀释)样品。

(4)检测器的选择

不同的分离目的对检测的要求不同，如测单一组分，理想的检测器应仅对所测成分响应，而其他任何成分均不出峰。另外，如果目的是定性分析或是制备色谱，则最好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分

岛津LC-20AT高效液相色谱操作步骤

1、流动相的处理

共有5个流动相储液瓶。一般RP-HPLC中，A（无机相）、B（有机相）为分析流动相；C（水）、D（甲醇）用于柱子后处理清洗；50%甲醇-水用于清洗自动进样针

流动相体积VA、B=100+总流速×比例系数×分析时间（mL）；Vc≥300mL； VD≈350mL；V50%甲醇≈300mL

所有流动相须用0.22um孔径滤膜过滤（根据有机相和无机相选用相应滤膜），清洗储液瓶，不能在清洗过程中留下污迹，并超声30min，超声完成后禁止剧烈摇晃

2、开机

开启插座电源 电脑开机

打开仪器电源（LC—20AT最后打开，等待数秒后“control”指示灯亮） 打开软件（Labsolution 仪器 LC—20A），若连接正常则软件显示 LC就绪

3、自动排气

将各流动相过滤头缓慢放入流动相中

在简单设置界面设置总流速为0.2mL/min；在自动排气界面设置自动排气参数（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ各流动相≥5min，自动进样器≥25min），不勾选“排气结束后运行控制器”

“下载” “执行自动排气”

等待排气结束

4、样品处理

稀释后的样品（浓度约1

岛津LC-20AT高效液相色谱操作步骤

1、流动相的处理

共有5个流动相储液瓶。一般RP-HPLC中，A（无机相）、B（有机相）为分析流动相；C（水）、D（甲醇）用于柱子后处理清洗；50%甲醇-水用于清洗自动进样针

流动相体积VA、B=100+总流速×比例系数×分析时间（mL）；Vc≥300mL； VD≈350mL；V50%甲醇≈300mL

所有流动相须用0.22um孔径滤膜过滤（根据有机相和无机相选用相应滤膜），清洗储液瓶，不能在清洗过程中留下污迹，并超声30min，超声完成后禁止剧烈摇晃

2、开机

开启插座电源 电脑开机

打开仪器电源（LC—20AT最后打开，等待数秒后“control”指示灯亮） 打开软件（Labsolution 仪器 LC—20A），若连接正常则软件显示 LC就绪

3、自动排气

将各流动相过滤头缓慢放入流动相中

在简单设置界面设置总流速为0.2mL/min；在自动排气界面设置自动排气参数（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ各流动相≥5min，自动进样器≥25min），不勾选“排气结束后运行控制器”

“下载” “执行自动排气”

等待排气结束

4、样品处理

稀释后的样品（浓度约1

..

高效液相色谱法习题

一、思考题

1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？

7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?

10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？

13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理

14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有

高效液相色谱法习题

一、思考题

1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？

7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?

10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？

13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理

14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同