RNAseq和转录组的区别

RNA-Seq名词解释

1.index

测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。

2.碱基质量值

（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。

3.Q30

碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。

4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）

每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。计算公式为

公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。

5.FC（Fold Change）

即差异表达倍数。

6.FDR（False Discovery Rate）

即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假

分类号

国际十进分类号（UDC）

密级

第四军医大学

学 位 论 文

基于RNA-seq技术的肝细胞肝癌转录组学研究

（题名和副题名）

指导教师姓名

指导教师单位申请学位级别

论文提交日期

论文起止时间

学位授予单位刘寒强 （作者姓名） 陈志南 教授/院士 第四军医大学基础部细胞生物学教研室 博士 专业名称答辩日期细胞生物学 200 年 月至2011 年 月 第四军医大学

独 创 性 声 明

秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我

个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。

申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。

论文作者签名： 日期：

保 护 知 识 产 权 声 明

本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在

校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部

第一章 转录组及转录组测序 第一节 前言

1953年，沃森与克里克对DNA双螺旋结构的精确描绘开创了生命科学的黄金时代，随后如火如荼的开展起来的人类基因组计划建立起庞大复杂的基因组数据库 使人类对了解生命本源和控制生命进程燃起无限憧憬。随着越来越多的基因测序工作渐渐完成，一本“写满生命密码的天书” 呈现在我们面前, 然而，接下来的问题更纷扰而至： 1) 这些基因有什么功能？

2) 不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程？ 3) 基因的表达是如何调控的呢？

4) 基因与基因产物之间是如何相互作用的呢？

5) 相同的基因在不同的细胞内的表达水平有差异吗？

6) 相同的基因处于疾病和治疗状态下的表达水平会有哪些改变？ 如何读懂这本“天书”是目前横亘在科学家们面前严峻的挑战。

因此，在人类基因组项目后，转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学不断涌现，生命科学研究已经跨入后基因组时代。其中，转录组学作为一个率先发展起来的学科是研究细胞表型和功能的一个重要手段，转录组高通量测序技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。

第二节

转录组分析

研究背景：

RNA-Seq是通过结合实验和计算方法来鉴定生物样品中RNA序列的种类和丰度的一种技术。通过RNA-seq，我们就能够确定单链RNA分子中ATCG的顺序。整个过程主要包括：从细胞或组织中提取RNA分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq技术具有许多早期研究方法（如：微阵列）所不具备的优点，如：RNA-Seq平台的高通量、新技术所带来的高灵敏度、发现新转录本、新基因模型以及非编码RNA的能力等。

RNA-Seq技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而RNA-Seq产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上的巨大差异、鉴定出新的转录本以及能够对small non-coding RNA和lncRNAs有着更好的了解。而且随着测序花费的降低，RNA-Seq的优势体现的更加明显。

服务流程：

样品选取

利用Oligo-dT富集mRNA

mRNA片段化

cDNA合成

末端修复、加polyA、加接头，PCR扩增

数据分析

测序方案：

内容：TotalRNA检测，普通转录组文库构建及测序及信息分析。 测序方式：H

一、生物信息分析流程

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：

二、项目结果说明

1 原始序列数据

高通量测序(如illumina HiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +

@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF

其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence

Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二

转录组分析上机文档

一、 过putty登录服务器

1. 通过SSH客户端putty登录服务器，以及安装xming

点击链接http://the.earth.li/~sgtatham/putty/latest/x86/putty.exe下载putty.exe，点击链接http://jaist.dl.sourceforge.net/project/xming/Xming/6.9.0.31/Xming-6-9-0-31-setup.exe下载xming，至任意位置，安装xming后运行程序。

双击打开putty，在Connection-SSH-X11栏，勾选“enable X11 forwarding”,在x11 display在location中填入“localhost:0”；在Session栏的主机地址输入服务器地址192.168.30.31，点击Load打开。如果出现安全警告框，点击YES。再输入用户名和密码登陆服务器。

设置linux的可视化界面：

登陆linux终端：

终端进入，欢迎界面：

二、 软件和数据

1) 分析用到的软件

基因组比对部分用到的软件是：

bowtie[官网：http://bowtie-bio.sourceforg

一、生物信息分析流程

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：

二、项目结果说明

1 原始序列数据

高通量测序(如illumina HiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +

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其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence

Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二

一、生物信息分析流程

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：

二、项目结果说明

1 原始序列数据

高通量测序(如illumina HiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +

@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF

其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence

Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二

转录组ref流程工作手册

一、Reference 流程生物学原理 1.1 实验流程

Total RNAeukaryoteEnriched mRNA by OligoTprokaryoteRemove rRNARNA fragment(200~700 bp)Random hexamer primed cDNA synthesisSize selection,then PCR amplificationSolexa Sequencing 图一：转录组实验流程

当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。测序基本过程：提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，

转录组ref流程工作手册

一、Reference 流程生物学原理 1.1 实验流程

Total RNAeukaryoteEnriched mRNA by OligoTprokaryoteRemove rRNARNA fragment(200~700 bp)Random hexamer primed cDNA synthesisSize selection,then PCR amplificationSolexa Sequencing 图一：转录组实验流程

当我们得到样品时，必须对其测序，才能得到分析所需的数据。测序基本过程：提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进入下一步）。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，