载体酶切后去磷酸化

质粒载体单酶切后的去磷酸化

1、 去磷酸化体系的确定：

一般有两种体系：20ul体系和50ul体系

ddH2O X to 20ul SAP buffer 2ul

SAP 1ul（一般0.05-2μg的DNA用1ul的SAP足够） 质粒载体 m ul [m=（0.02nmol*质粒大小kb*660）/质粒浓度] 2、 反应条件：

37℃反应30-60min

65反应15-30min（灭活SAP）

用1X TE将去磷酸化后的载体补足300ul（为了下一步纯化载体时减少损失）

载体纯化（个人不建议用胶回收柱纯化，因为纯化的效率很低，除非你的载体浓度很高或者你的柱子效率很高。建议使用酚氯仿纯化DNA的方法纯化载体） 加入 酚：氯仿：异丙醇（25: 24:1） 300ul 充分混匀10min左右

8000rmp离心5min，分层后小心吸取上清于新离心管（千万不要吸到中间层，宁肯少吸点上清）

加入300ul异丙醇于上清中，充分混匀

80

蛋白质磷酸化与信号传导

蛋白質磷酸化與信號傳導

對所有真核生物而言，蛋白質的磷酸化是細胞內信號傳遞的關鍵步驟，舉凡在細胞代謝、生長、增殖、癌變調控方面，蛋白質的磷酸化都扮演著重要角色。目前在真核細胞內已發現有400多種蛋白激酶和1000多種磷酸蛋白。通過蛋白質磷酸化，機體得以改變細胞內蛋白質活性，或藉以改變酵素活性、或藉以傳遞信號、或調節細胞內各個生理過程。隨著愈來愈多的信號傳導路徑被證實與蛋白質磷酸化相關，此一主題己是當今細胞生物學研究的熱點。

蛋白質的可逆磷酸化

蛋白質的磷酸化和去磷酸化是一個可以相互轉化的過程，分別由機體藉由調控細胞內各類蛋白激酶（protein kinases）和蛋白磷酸酶（phosphatases）的活性來啟動或抑制。通過磷酸化和去磷酸化兩種構象的互變，導致蛋白質活性改變而表達其特殊的生理功能。現已證實，細胞的許多功能蛋白，如激酶、酶蛋白、受體、視蛋白、運輸蛋白、收縮蛋白、調節蛋白、核蛋白、離子通道、離子幫浦等，均能發生蛋白質的磷酸化與去磷酸化。蛋白質磷酸化的方式有兩種：一種是蛋白質自身磷酸化，如胰島素受體、C激酶、G激酶、Ca2+·CaM激酶、EGF受體、PDGF受體、IGF-1受體、FGF受體、CSF-1受體、

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因cDNA克隆及其在甲醇毕赤酵母中的表达

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2005,13(3):282~287

··研究论文

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基

基因(的克隆及其在毕赤酵母中的表达*

宋波涛柳俊**谢从华成善汉

(华中农业大学园艺林学学院，国家蔬菜改良中心华中分中心，园艺植物生物学教育部重点实验室，

湖北省马铃薯工程技术研究中心，武汉430070)

摘要：用RT-PCR结合RACE的方法，在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(温处理的马铃薯(

目标片段为体。DNA序列测定结果表明，

从低的保守位点设计1对引物，

L.)块茎cDNA中，扩增出1条约1.9kb的特异性条带，并将其克隆到pBluescriptSK域载

编码521个氨基酸。全长为1854bp，包含一个1563bp的开放阅读框架，5'端

有63bp的非翻译区，3'端包含219bp的非编码序列，3'端poly(A)尾端上游12和19bp处有加尾信号AATAAA。该基因已在GenBank注册，登记号为AY186620。将该基因PCR突变后，克隆到酵母表达载体pMET琢-B中，构成表达

NovelZincPhosphateTopologiesDefinedbyOrganicLigands

JianFanandBrianE.Hanson*

DepartmentofChemistry,VirginiaPolytechnicInstituteandStateUniVersity,Blacksburg,Virginia24061

ReceivedMarch1,2005

Sixnewzincphosphates[C18H20N4][Zn4(HPO4)4(H2PO4)2(C18H18N4)3] 2H2O(1),[Zn4(HPO4)4(C18H18N4)3] 4H2O(2),[Zn3(HPO4)3(H2PO4)(C22H22N8)0.5(C22H24N8)0.5](3),[Zn2(HPO4)2(C18H16N4)](4),[Zn(HPO4)(C18H14N2)](5),and[Zn2-(HPO4)2(C12H10N4)](6)havebeensynthesizedundermildhydrothermalconditionsinthepresenceof1,4-bis(N-benzimidazolyl)butane(L1),1,2,4,5-tet

4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)： 1、试剂配制 （1）甲苯

（2）磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚） （3）缓冲液

（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液： 硼酸盐缓冲液（pH9.0）

A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中 B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中 硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得

缓冲溶液配制：

(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)

A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。 B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL 醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB混合即得 （2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0） 硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：

A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中

B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中

50mLA＋4

BioTek应用手册

A p p l i c a t i o n N o t e

药物筛选

一种常见的GPCR传感器-ERK1/2的自动均相磷酸化检测 -均相LanthaScreen®细胞分析

Paul Held and Peter Banks, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT

Kristin Huwiler, Matthew Robers, and Bonnie Hanson, Life Technologies, Madison, WI

关键词：GPCR, LanthaScreen, ERK，TR-FRET

GPCRs的激活会刺激活化各种信号通路，大部分信号通路的激活均可能导致细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化。因此，针对ERK1/2的磷酸化检测可以代替GPCRs的活性检测。本文介绍了一种将BacMam调节的GFP-ERK2 传感器基因传递技术和LanthaScreen®细胞学实验技术相结合的时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET），该技术用来检测ERK2细胞外的磷

遗传分子生物学实验

质粒DNA DNA的限制性内切酶酶切 实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切

遗传分子生物学实验

一 实验目的了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 DNA

限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 DNA DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 水解酶 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 重组中重要的工具

遗传分子生物学实验

第一类( 第一类(I型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点 限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序， 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链， DNA分子中的双链 有专一性，是随机的。这类限制性内切

中国药物与临床2012年1月第12卷第1期Chinese Remedies &Clinics ，January 2012,Vol.12,No.1肺间质纤维化是一种渐进性加重的致命性弥漫

性肺疾病。肺内成纤维细胞和损伤的气道上皮细胞

向肌成纤维细胞转分化是特发性肺纤维化发生的重

要病理因素［１］，α鄄平滑肌肌动蛋白（α鄄ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ

ａｃｔｉｎ，α鄄ＳＭＡ）是研究肌成纤维细胞分化的标记物。

近年来，肺纤维化转分化病理过程中涉及到的信号

通路一直是研究的热点。ｃ鄄ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ鄄ｊｕｎ

ＮＨ２鄄ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）

信号通路参与调控许多细胞增殖、分化与凋亡，是丝裂原活化蛋白激酶家族的

重要一员［２］。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等［３］发现ＪＮＫ信号通路在人肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中发挥作用，而关于体内ＪＮＫ信号通路在肺纤维化转分化过程中是否发挥作用尚未见相关研究报道。ＳＰ６００１２５作为ＪＮＫ激酶抑制剂，可特异性阻断ＪＮＫ细胞信号通路［４］。本实验使用ＳＰ６００１２５进行干预，通过观察大鼠肺组织中ｐ鄄ＪＮＫ和α鄄ＳＭＡ的表达水平，从分子信号角度探讨肺纤维化转分化的发病机制。1材料与方法１．１主要试剂及药品：盐酸博莱霉素（ＢＬＭ，

钙调磷酸酶抑制剂

（一）器官移植排斥反应

1、移植排斥反应

人体的免疫系统对各种致病因子有着非常完善的防御机制，能够对细菌、病毒、异物、异体组织、人造材料等“异己成分”进行攻击、破坏、清除，这种复杂的免疫学反应是人体非常重要的一种保护机制。受者进行同种异体组织或器官移植后，外来的组织或器官等移植物作为一种“异己成分”被受者免疫系统识别，后者发起针对移植物的攻击、破坏和清除，这种免疫学反应就是移植排斥反应（transplant rejection）。移植排斥反应是影响移植物存活的主要因素之一。

移植排斥反应是非常复杂的免疫学现象，涉及细胞和抗体介导的多种免疫损伤机制，发生原因主要是受体和移植物的人类白细胞抗原HLA（human leucocyte antigen）不同。因此，供者与受者HLA的差异程度决定了排异反应的轻或重。除同卵双生外，二个个体具有完全相同的HLA 系统的组织配型几乎是不存在的，因此在供受者进行配型时，选择HLA配型尽可能地接近的供者，是减少异体组织、器官移植后移植排斥反应的关键

2、发病机制

排斥反应的发生机制主要包括细胞免疫和体液免疫两个方面。临床最常见的急性排斥反应主要由细胞免疫介导，而超急性排斥反应和慢性排斥反应主要由

限制性内切酶酶切位点

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