mtt细胞毒性

细胞毒性药品临床使用管理办法

一、细胞毒性药物的定义

指在生物学方面具有危害性影响的药品，可通过皮肤接触或吸入等方式造成包括生殖系统、泌尿、肝肾系统的毒害，还有致畸或损害生育功能。这里主要指细胞毒药物。

二、细胞毒性药物的使用

（一）应严格按照NCCN指南（美国国家综合癌症网络）推荐的细胞毒性药物的用法用量合理应用。

（二）应高度重视、注意观察细胞毒性药物可能出现不良反应的情况。

（三）细胞毒性药物的配臵和使用需要由受过相关培训的人员，按照标准操作规程和相关规定配臵细胞毒性药物，配臵和使用时应有防护措施。

（四）配臵和使用人员应根据情况选用一定的防护措施。

（五）孕妇或疑已怀孕者，应避免处理细胞毒药物。

三、细胞毒性药物的贮存

（一）医院各药房细胞毒药物的存放应与药品储存要求相符，专柜集中存放并有明显标识，不得与其他药品混合存放，药名和外包装相似药品应有标志区分。

（二）病房原则上不存放细胞毒性药物，现用现领。确实需要，亦专柜（专区）存放并有明显标识。

四、细胞毒性药物的应用流程

（一）主管医生对病人进行全面评估，决定病人的化疗治疗，并与病人或者委托人谈话后签署《化疗知情同意书》。

（二）由有资质的护士进行化疗操作，包括配制和使用。

（三）医护人员对化疗病人及家属做好宣教

MTT法绘制生长曲线

一 细胞生长曲线：

A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 24培养板

4. 胶塞

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

（四）、操作步骤

1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要

一、淋巴细胞转化试验（MTT）

（一）原理：

四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

（二）材料：

MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原

（三）方法： 1、脾细胞制备：

（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；

（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；

（4）制备脾细胞悬液

①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用

MTT法绘制生长曲线

一 细胞生长曲线：

A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 24培养板

4. 胶塞

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

（四）、操作步骤

1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要

细胞增殖检测：MTT实验经验总结

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞

同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色

培养3－

MTT：

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉

语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，简称：四唑盐。商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

原理：

MTT产品为淡黄色粉末，易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内，被活细胞线粒体脱氢酶还原形成不溶于水的蓝紫色甲臢结晶并沉积于细胞中，死细胞和红细胞无这种能力。结晶物形成的量与细胞数量和代谢活性成比例，因此吸光度A值大小可以反映细胞数量和活性。 在细胞MTT法测定过程中，细胞还原MTT所形成的甲臢培养物不溶于细胞液，需加入有机溶剂使细胞裂解，甲臢颗粒溶解便于比色。

应用：

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

评价：

优点：特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

方法：

①制备靶细胞（适宜浓度）。②加入待测的细胞因子或化学药物，37 ℃、5

在园中看了很多帖子，在网上也查了很多帖子，但是都没有详细介绍如何用SPSS处理MTT结果的详细步骤（大家都是轻描淡写，也没有教详细的步骤），经过自己查阅书籍将具体的

方法总结如下，方便各位战友的学习。希望版主能加分！！！

SPSS处理MTT结果的方法及步骤

一、如下表所示：我们需要计算出某一浓度下某个时间点的细胞抑制率，并对计算出的数据进行统计学处理，比较（1）：同一浓度下不同时间点的细胞抑制率是否有统计学差异；（2）：相同时间不同浓度下的细胞抑制率是否有统计学差异；

不同浓度某药物作用下某种细胞株的生长抑制率 (`x±SD )( % ) ( n=3 )

浓度(?mol/L) 24h 48h 72h 200 150 100 50 25 12.5

1、选择统计学方法

单因素方差分析

2、处理原始数据

图中抑制率1、抑制率2、抑制率3分别代表重复三次的实验数据。

将上述原始数据分别变成下列形式以利于SPSS中的计算

3、打开SPSS输入数据（以下以同一浓度不同时间为例做示范）

4、修改变量视图

5、设定值

在园中看了很多帖子，在网上也查了很多帖子，但是都没有详细介绍如何用SPSS处理MTT结果的详细步骤（大家都是轻描淡写，也没有教

胃肠外营养的分级管理制度

为促进我院合理使用胃肠外营养药品，经药事管理委员会和药物治疗学委员会讨论，特制订本制度，以促进合理用药。

一、肠外营养()包括氨基酸（1）、脂肪乳（2）、维生素（1）、微量元素（3）、磷（3）等

二、临床合理应用胃肠外营养类药物，使用原则参照我院制定的胃肠外营养何时使用指南。

三、进行处方点评和病历点评时严查胃肠外营养用药情况，严惩非适应症，无适应症和超适应症情况的发生。对滥使用的临床医师视情况给予处分、警告、处罚、停职等处理。

四、胃肠外营养分三级管理。

糖皮质激素临床应用的管理

一、临床管理

1、冲击疗法需具有主治医师以上专业技术职务任职资格的医师决定。

2、短、中程糖皮质激素治疗时，需具备医师职务任职资格的医师开具，且严格掌握适应症，品种选择原则上使用国家基本药物目录内的品种。

3、长程糖皮质激素治疗方案，需相应学科副主任医师以上专业技术职务任职资格的医师决定。

4、先天性肾上腺皮质增生症的长程治疗方案制定需三级医院内分泌专业副主任医师以上专业技术职务任职资格的医师决定。

随访和剂量调整可由内分泌专业副主任医师以上专业技术职务任职资格的医师决定。

5、严格限制没有明确适应症的糖皮质激素的使用，如不能纯正以退热和止痛为目的使用糖皮质激素。

MTT实验

MTT实验第一阶段 细胞培养：细胞传代与冻存…（此处略，苹果你已会！）

MTT实验第二阶段（自己总结）

细胞种板：往96孔板中接种适宜数量的细胞，并保证细胞在96孔板小孔中均匀分布，正常生长，是MTT实验成功的首要条件。

主要步骤：

（1）.细胞生长：保证细胞处于对数生长期，简而言之就是将已基本铺满培养瓶底的细胞进行消化，但不传代，就是将旧的培养基换掉，让贴壁的细胞悬浮，并培养一天。此时细胞处于对数生长期，细胞活力最好，有利于MTT实验的结果。

（2）.细胞消化：将昨天的细胞吸去旧的培养基（将死细胞吸走，可用过滤灭菌的PBS溶液轻轻冲洗细胞），加入胰酶消化，随后加入适宜培养基（不宜过多，勿将细胞稀释的过稀，达不到种板所需的细胞浓度要求）。切记利用吹打管将细胞吹打均匀（大量细胞会聚集在一起，细胞分散不均，吹打不匀会影响细胞计数的准确性及随后种板的均一性）；但吹打过猛过多也会影响细胞活力。

（3）.细胞计数：计数之前，应用75%酒精将计数器其载玻片擦拭干净，以免上面残留杂质影响细胞计数。取一小滴（估计20ul左右）吹打均匀的细胞培养液沿细胞计数器上端凹槽轻轻缓慢打出滴下，此时小液滴会自动（虹吸原理）铺满细胞计算器的上部小方块（如图1

MTT原理：

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。

MTT 溶液的配制方法：

通常，此法中的 MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

实验步骤：

（1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积20