mrna差别显示技术克隆差异表达基因的原理

mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）

随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。

差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。 差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。如在1994年，Ito等对3′端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的

拟南芥基因的图位克隆技术

拟南芥基因的图位克隆技术

浙江大学生命科学学院 徐冰

浙江杭州 310029

1 国内外研究现状

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。

从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。

图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等， 2002）

图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（po

微囊藻毒素LR对碱基切除修复基因和凋亡相关基因mRNA表达的影响

微囊藻毒素ＬＲ对碱基切除修复基因和凋亡相关基因ｍＲＮＡ表达的影响

胡志坚陈华赖招霞

彭仙娥孙元设

吕鹏

【摘要】

目的探讨微囊藻毒素Ｉｍ（ＭＣＬＲ）对碱基切除修复基冈和凋亡相关基因ｍＲＮＡ表达的

影响。方法用不同剂量（０、１、５、ｌＯ、３０斗ｇ／ｍ１）的ＭＣＬＲ对大鼠肝细胞株ＢＲＬ－３Ａ进行不同时间（２４、４８、７２ｈ）的染毒，用噻唑蓝（ＭＺｒ）法检测细胞存活率，同时用反转录一聚合酶链反应（ＲＴ．ＰＣＲ）方法测定碱基切除修复基闪和凋亡相关基因ｍＲＮＡ表达情况。结果ＢＲＬ－３Ａ细胞存活率随ＭＣＬＲ染毒剂量升高和染毒时间延长而降低。ＢＲＨ３Ａ细胞在ＭＣＬＲ作用２４ｈ时，３０ｔｇ／ｎａ剂量组ｐ５３基因的ｍＲＮＡ表达量（１．３２７±０．０２８）增高，明显高于其他各组（分别为１．００５±０．１１７、０．８６２±０．１５４、１．０２８±０．０５６、１．０１５±

０．０９１）。差异有统计学意义（尸锄．０５ｏ同样，在ＭＣＬＲ作用２４ｈ时，各组Ｂｏｘ基因ｍＲＮＡ表达水平也增

高，１、５、１０、３０Ｉ＿Ｌｇ／ｍｌ染毒组Ｂａｘ基因ｍＲＮＡ表达水平（分别为５．０８０&#

长沙三济个体化用药基因扩增检验室 标准操作规程文件 文件名：ERCC1mRNA表达水平基因检测 （荧光定量PCR）标准操作规程

文件号：YLPCR-SOP-24 版号/修订号： 1/0 页 号： 第 1 页 总页数： 共 6 页 日 期：20110808 1. 目的：规范ERCC1mRNA表达水平检测（荧光定量PCR）操作流程，保证检测结果准确性。 2. 项目名称： ERCC1mRNA表达水平检测。

检测方法：荧光PCR。

3. 方法原理：PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术。 4. 仪器：博日荧光定量PCR扩增仪。 5. 操作步骤：

5.1 样本RNA提取(样本室) 5.1.1

根据《临床标本采集、验收、拒收标准操作规程》接收合格的临床检测样本（同一

患者的正常组织样本和肿瘤组织样本各一份）。 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5

从试剂盒中取出组织RNA提取需要用到的试剂, 室温融化后，2000rpm离心10sec； 参照《组织样本RNA提取标准操作规程》提取正常组织样本和肿瘤组织样本的RNA。 提取的RNA样本需要在24小时内进行逆转录操作，否则需置于-80℃保存。 RNA提取后剩余的组织样本置于-80℃保存，备查。

长沙三济个体化用药基因扩增检验室 标准操作规程文件 文件名：ERCC1mRNA表达水平基因检测 （荧光定量PCR）标准操作规程

文件号：YLPCR-SOP-24 版号/修订号： 1/0 页 号： 第 1 页 总页数： 共 6 页 日 期：20110808 1. 目的：规范ERCC1mRNA表达水平检测（荧光定量PCR）操作流程，保证检测结果准确性。 2. 项目名称： ERCC1mRNA表达水平检测。

检测方法：荧光PCR。

3. 方法原理：PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术。 4. 仪器：博日荧光定量PCR扩增仪。 5. 操作步骤：

5.1 样本RNA提取(样本室) 5.1.1

根据《临床标本采集、验收、拒收标准操作规程》接收合格的临床检测样本（同一

患者的正常组织样本和肿瘤组织样本各一份）。 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5

从试剂盒中取出组织RNA提取需要用到的试剂, 室温融化后，2000rpm离心10sec； 参照《组织样本RNA提取标准操作规程》提取正常组织样本和肿瘤组织样本的RNA。 提取的RNA样本需要在24小时内进行逆转录操作，否则需置于-80℃保存。 RNA提取后剩余的组织样本置于-80℃保存，备查。

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA的克隆与表达

周文婷1，崔羽，王晓燕2，张永红，李世荣，李景鹏*

（东北农业大学生命科学与生物技术中心，哈尔滨 1500301；

哈尔滨医科大学附属第四医院检验科，哈尔滨 1500012）

摘 要： 类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用，由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物，利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADH1，ADH2和ADH3的酶活力分别为1.8± 0.3U/mg, 0.9±0.2U/mg和1.4±0.2U/mg。

关键词：乙醇脱氢酶（ADH）；基因克隆，原核表达；酶活力检测1

酒是重要的

根据GenBank中报道的猫白介素-18基因(IL-18)序列,对用ConA刺激的实验猫外周血单核细胞(PBMCf)进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T中得到重组质粒pTIL-18,进行核苷酸序列测定,并与不同物种的IL-18基因进行了序列比较。结果该基因全长579bp,编码1

农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(2):198~202 

· ·研究论文

猫白介素 ­18基因的克隆、 序列分析及其表达 * 

 3 

乔 军 1，, 夏咸柱 1 **, 杨松涛 1,2 , 鞠会艳 1,2 , 黄 耕 1

（1.解放军军事医学科学院军事兽医研究所,长春130062 2.吉林大学农学部,长春130118  

3. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 兰州 730046) 

摘要：用猫白介素18(interleukin, （ConA） （PBMCf） 刺激

?类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶?类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性

乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA的克隆与表达

周文婷1，崔羽，王晓燕2，张永红，李世荣，李景鹏*

（东北农业大学生命科学与生物技术中心，哈尔滨 1500301；

哈尔滨医科大学附属第四医院检验科，哈尔滨 1500012）

摘 要： 类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用，由ADH1、ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物，利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶 类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过检测其在340nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADH1，ADH2和ADH3的酶活力分别为1.8± 0.3U/mg, 0.9±0.2U/mg和1.4±0.2U/mg。

关键词：乙醇脱氢酶（ADH）；基因克隆，原核表达；酶活力检测1

酒是重要的

基因克隆

中国病原生物学杂志

454

JournalofPathogenBiology

December2007,　Vol.2,　No.6

2007年12月　　第2卷第6期

论著

白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段的克隆及其3

作为基因表达内参照的应用

焦健华1,2,马磊2,张东辉233

(1.南京医科大学第一附属医院消化科,江苏南京210029;2.南京医科大学病原生物学系,

江苏省现代病原生物学重点实验室,江苏南京210029)

【摘要】　目的　获取白纹伊蚊β2肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。　方法　根据昆虫β2肌动蛋白核苷酸序列的高度保守区设计引物,通过PCR的方法从白纹伊蚊C6/36β2肌动蛋白基因片段,进一步通过RT2PCR的方法验证其在稳定转染空载体和40SC6/36细胞中的表达。　结果　获得白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段,长91189%以上。在稳定转染空载体和RPS4基因的36。　结论　成功获得了白纹

伊蚊β2肌动蛋白基因片段,。【关键词】　白纹伊蚊;PCR;RT2PCR

【中图分类号】　　A　　　【文章编号】　167325234(2007)0620454203

[JournalofPathogenBiology.2007Dec;2(6)

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体(SLC7a8)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠(wistar-kyoto,WKY)肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质

第 41卷第 6期 2 01 1年 1 1月

温

州

医

学

院

学

报

Vo1 . . No 6 41No 2 v. 011

J u na f W e z o e i a le e o r l o n h u M d c lCo l g

■大鼠 S C a基因的克隆及真核表达载体的构建 L T8王本极，黄晓燕，林素，周希，戴晓春，方俊旭，杨德业( . JJ 1温，医学院附属第一医院心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江温Jl 3 5 0 i、 i 200、2温州医学院 .眼视光学院，浙江温州 3 5 0 ) 2 0 0

■

[摘

要]目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体 (L 78 SCa )基因eN