筛选重组质粒转化菌的方法

重组质粒的转化

重组质粒的转化(热休克法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:

1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。

4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类 氨基酸 维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋

利用不同的方法筛选与鉴定转化子

院系： 生命科学学院

专业：生物工程

班级：10生物工程一班

姓名： 周伟竞

学号：1014200006

摘要 本文通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验

方法，通过α-互补筛选（蓝白斑）从转化子中筛选重组子，由于pET32-CaM5 Vector上带有lacZ基因，因此可以通过菌落直接PCR的分子鉴定，可以鉴定细菌中有没有转入外源DNA；然后再挑取单菌落进行培养、提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小；最后用限制性内切酶切割大小符合的质粒，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。

关键词 菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定

前言

通过本次的一系列实验操作，目的是为了能够筛选出含有pET32-CaM5质

粒的大肠杆菌DH5α，并进行鉴定该转化子。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点，若要克隆较小的DNA片段（<10kb）且结构简单，则质粒是最好使用的了。因为在实际操作过程中，用重组质粒转化的大肠杆菌DH5α的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。 二、摘要：

利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子。因为不含有pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α是不能再含有抗生素的培养基上生长的，而含有重组质粒的细菌则能够在该培养基上生长，采用A mp抗性筛选，所以就

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类 氨基酸 维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

蛋白酶产生菌的筛选

组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：***

一、实验目的

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容

蛋白酶产生菌的分离

三、实验原理

许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

四、实验材料和用具

1.材料：土壤样品

2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL

无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、

3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇

床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

杆菌类产生蛋白酶分解蛋白质。

五、操作步骤

（一） 配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，

琼脂 1.5～

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类 氨基酸 维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋

染料脱色菌的筛选及脱色特性研究

1 前言

水是人类生存之源，发展之本，是环境构成中最活跃的因素。我国常年水资源总储量为2.81万亿m3，居世界第6位，而年总用水量为5 500亿～5 600亿m3，整体上能够满足需求。但由于我国人口众多，人均水资源占有量不足2 150 m3，为世界人均水资源占有量的1/4，位列世界110位，是联合国认定的“水资源最为紧缺”的13个国家之一。而且，随着人口的增长，工业化、城市化以及灌溉对水的需求量日益增加，加之水资源时空分布不均、水污染、水生态系统失衡等问题加剧了当前水资源供需矛盾，使我国水资源危机越发凸显，进而成为我国经济发展的严重制约因素之一。据美国对外关系委员会亚洲研究中心的报告，中国668个城市中440个已出现长期缺水问题。20世纪90年代以来，国家累计投入600亿元治理江河污染，相关部门也大力采取防污治污的措施，使得河流、湖泊、水库的水质基本保持稳定，局部有所改善。但据《中国环境状况公报》显示，2007年我国水污染形势依然严峻，监测的197条河流的407个断面中，Ⅰ～Ⅲ类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为49.9 %、26.5 %和23.6 %。因此，防治水资源污染，提高水环境质量，已成为当务之急。

纤维素分解菌群的分离和筛选

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(南京农业大学自然资源与环境科学院，京 2 0 9 )南 1 0 5摘要滤纸平扳法结合摇床培养筛选到 2纤维素分解能力较强的混合菌 Ml M2在以纤维素为碳源的个和。

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培养涟中，8 C振荡培养 4,纸纤维素失重率分别达 5 . 3和 5 . 2,经处理的稻草秆纤维素失重 2 滤 d 75 4 9未率为 3 . 2和 3 . 1。膨化稻草比稻草秆易分解，维素降解率可达 6 . 3和 6 . 2。经初步鉴定， 88 6 2纤 8 8 0 0 Ml由术霉和芽孢杆菌 B a组成， M2由术霉 F 2和芽孢耗菌 B a组成。实验结果表明，由真菌、细菌组成的混合菌分解纤维素的能力嘎显强千其中任何一个单一菌株，

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