拟南芥原生质体转化效率低

拟南芥原生质体制备转化操作流程

主要试剂

1. 纤维素酶解液： 试剂

15ml酶液体系

1． 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g干粉

2． 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g干粉 3． 0.4M mannitol 1.09g干粉 4． 20mM KCl 1 ml 0.3 M KCl母液

5． 20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6． 加入10ml 水

7． 55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂 8． 10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2

9． 5 mM β-Mercaptoethanol（可选用） 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪ BSA， 1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）

11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。

2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品

水稻原生质体分离及转化

作者：植物逆境与光合实验室 | 发表日期：2014-04-11

实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验

实验材料和试剂：

生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。

溶液的配制： 母液的配制：

1、0.2 M MES(pH 5.7) 2、0.8 M Mannitol(甘露醇) 3、1 M CaCl2 4、2 M KCl 5、2 M MgCl2 6、10% BSA

[Fluka PEG 4000 81240]

以下如有上述母液，则都是使用的母液

酶解液：20 mL ×2 MES 0.5

mL

原生质体制备方法

培养基：

① PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水

② MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、PH6.5

③ MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、0.5mol蔗糖、1L

水、PH6.5

④ MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、0.5mol

蔗糖、PH6.5

试剂：

① 1mol/L MgSO4 ② 0.5mol/L MgSO4

③ STC：0.8M 山梨醇、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ④ 肝素

⑤ SPTC：0.8M 山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ⑥ 无菌水

操作步骤：

① 倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days

② 用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG

液体培养基中，120rmp，28℃，12h

③ 以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④ 混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤

原生质体制备方法

培养基：

① PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水

② MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、PH6.5

③ MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、0.5mol蔗糖、1L

水、PH6.5

④ MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、0.5mol

蔗糖、PH6.5

试剂：

① 1mol/L MgSO4 ② 0.5mol/L MgSO4

③ STC：0.8M 山梨醇、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ④ 肝素

⑤ SPTC：0.8M 山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（PH8.0）、50mM CaCl2 ⑥ 无菌水

操作步骤：

① 倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days

② 用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG

液体培养基中，120rmp，28℃，12h

③ 以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h ④ 混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤

植物原生质体的融合技术探析 本文关键词：质体，探析，融合，植物，技术

植物原生质体的融合技术探析 本文简介：原生质体是组成细胞的一个形态结构单位,原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体,Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液,在一定条件下培养

植物原生质体的融合技术探析 本文内容：

　　原生质体是组成细胞的一个形态结构单位, 原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”, 是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体, Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液, 在一定条件下培养一段时间后, 发现大部分细胞的细胞壁被降解, 从而制备出大量有活力的原生质体。

　　1、原生质体融合的目的及意义

　　原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力, 使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合, 进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞, 克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍

平菇及杏鲍菇原生质体的分离与再生

一：材料及用具

1:固体培养基

PDA固体培养基:马铃薯200g/l，蔗糖20g/l,琼脂20g/l,水1000ml， PH自然;

SPA固体培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,琼脂粉12g, 0.6M甘露醇溶液1000ml.

2:液体培养基：马铃薯200g/l，蔗糖20g/l,水1000ml ，PH自然; 3：再生固体培养基：

PDA固体再生培养基：马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g，0.6M甘露醇溶液1000ml.

SPA固体再生培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,琼脂粉12g, 0.6M甘露醇溶液1000ml. 4:再生液体培养基：

PD液体再生培养基：马铃薯200g,蔗糖20g，0.6M甘露醇溶液1000ml.

SP液体再生培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g， 0.6M甘露醇溶液1000ml.

5:酶制剂：溶壁酶1.5%（用灭过菌的稳渗剂配制） 6:稳渗剂：0.6M的甘露醇；

7:菌株：平菇菌株（平菇1500，2002-4,1218，黑8，冀农11,50869,1206,8902）.杏鲍菇菌株.

8:用具：小刀，玻璃棒，大瓷缸，试管，三角瓶，培养皿，纱布，离心机，小指管，镊

实验九 植物原生质体的分离和培养

实 验 目 的

掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。

实 验 原 理

原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。

植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生体的材料来源。

分离愿生厦籀萨采用酶解法。其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组麟，以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯既，然后进行培养。

实 验 用 品

一、材料

1.烟草幼苗的叶片、或向日葵无菌苗的叶片、子叶或下胚轴等。 2.胡萝卜根切片诱导的松软愈伤组织。

二、器材

超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、培养

第九章 原生质体培养和体细胞杂交

本章大纲 9.1 原生质体的分离与纯化 9.2 原生质体培养 9.3 体细胞杂交

什么是植物原生质体？ 什么是植物原生质体？植物原生质体(protoplast)是去掉细胞壁的由质膜 是去掉细胞壁的由质膜包裹、 包裹、具有生活力的细胞 是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料仍保持植物细胞的全能性 仍能进行植物细胞的各种生命活动

是植物遗传转化的理想受体膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、 膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、 DNA 细胞核、 细胞核、甚至 病毒颗粒等

原生质体

植物细胞

9.1 原生质体的分离与纯化9.1.1.1 材料的选择几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体 每一部分 叶片、愈伤组织、悬浮培养的细胞都可制备原生质体 叶片、愈伤组织、 叶片是最常用的材料 叶片是最常用的材料 一般选用结构疏松并处于对数生长期 结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系 一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系 分离原生质体效果较好 一般选用生长旺盛 生命力强的组织作为分离原生质 生长旺盛、 一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质 体的材

用玉米叶肉原生质体进行瞬时表达实验（PEG转）

一、生长条件

将玉米种子浸泡过夜，然后移到蛭石和营养土各半的培养基中光照生长3天（地上部分大约1cm左右），再移到黑暗条件下生长直到第二片叶的长度比第一片叶长10-15cm，这需要在25℃条件下生长10-11天。只浇水不用施肥。为了防止细菌生长，可往培养基中加入50-100g/ml 的 Amp。黄化叶片的原生质体可用于实验，茎和根也可以用，但尽量避免用绿色的叶片。 二、原生质体分离

切取第二片叶的中部（6-8cm）。将20片叶叠在一起，轻压，切成0.5mm的条，不要损伤叶片。刀片用95%的酒精清洗。1克含有5×106的原生质体可做50个反应。

在250ml的容器中放入10-20ml的酶液，放入切好的叶片，抽真空30min，40rpm轻摇，继续消化3-4hr。通常消化时间往往在黑暗条件下延长至16-18h。在显微镜下检测原生质体的完整性，玉米叶肉原生质体的大小为25-35um。80rpm继续震荡5min，使原生质体完全释放。 三、纯化

1、将消化好的原生质体用74uM的滤网过滤到10ml离心管中，原生质体用枪转移，需剪掉枪头。

2、4℃，100xg离心2min，吸掉上清（需剪枪头），将原生质体迅速

平菇及杏鲍菇原生质体的分离与再生

一：材料及用具

1:固体培养基

PDA固体培养基:马铃薯200g/l，蔗糖20g/l,琼脂20g/l,水1000ml， PH自然;

SPA固体培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,琼脂粉12g, 0.6M甘露醇溶液1000ml.

2:液体培养基：马铃薯200g/l，蔗糖20g/l,水1000ml ，PH自然; 3：再生固体培养基：

PDA固体再生培养基：马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g，0.6M甘露醇溶液1000ml.

SPA固体再生培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g,琼脂粉12g, 0.6M甘露醇溶液1000ml. 4:再生液体培养基：

PD液体再生培养基：马铃薯200g,蔗糖20g，0.6M甘露醇溶液1000ml.

SP液体再生培养基：蔗糖20g,蛋白胨5g,酵母粉5g， 0.6M甘露醇溶液1000ml.

5:酶制剂：溶壁酶1.5%（用灭过菌的稳渗剂配制） 6:稳渗剂：0.6M的甘露醇；

7:菌株：平菇菌株（平菇1500，2002-4,1218，黑8，冀农11,50869,1206,8902）.杏鲍菇菌株.

8:用具：小刀，玻璃棒，大瓷缸，试管，三角瓶，培养皿，纱布，离心机，小指管，镊