流式细胞术实验报告

流式细胞术讲义

流式细胞术的血液学应用

北京协和医院血液科 汪 玄

流式细胞术讲义

流式细胞术的概念

流式细胞术(Flow cytometry;FCM)是集计算 机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化 学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现 代细胞分析技术，它以流式细胞仪(Flow cytometer)为工具，在单细胞水平上对大量细胞 进行高速(每秒计数可达1000~10000个细胞)、准 确、多参数的定量分析或分选(纯度可达99%以 上),已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分 析技术。

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流式细胞术与PNH的诊断

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原 理

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是 一种获得性基因突变所致的克隆性疾病， 其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂-锚 (GPI-anchor)连接蛋白如CD59,CD55 等表达明显减低或缺乏，导致对补体的敏 感性增强而产生溶血性贫血。

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样本要求： EDTA抗凝血或骨髓3ml 每天上午送检

收费：CD55/CD59

CD59

280元 140元

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临床诊断值 CD59阳性的红细胞大于等于95% CD59阳性的中性粒细胞大于90%

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流式细胞术与 白血病免疫分型

第一章流式细胞仪的结构和原理

第1节流式细胞术发展史

纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15 种荧光信号；③从检测参数的相对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中

写在课前的话

流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。

一、流式细胞术概念 (一) 概念

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。

(二) 流式细胞术的特点

1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

2.

流式细胞仪实验方法

一、 实验准备 1． 标本制备：

2． 最小化非特异性结合：

二、凋亡

1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法

三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA

四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板

五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞

六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分 标本处理

一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法

取一定量细胞(约1X10细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法

取一定量

流式细胞术

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vanta

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述 第四节 流式细胞仪技术的要求 一、工作原理 第五节、流式细胞仪的科研应用 二、散射光的测定 三、荧光测量 第六节 流式细胞术在临床检测中的 四、细胞分选原理 主要应用 一、细胞周期和DNA倍体分析 第二节 数据的显示与分析 二、染色体分析 一、参数 三、细胞表面标志的检测 二、数据显示方式 1、淋巴细胞及其亚群的分析 三、设门分析技术 2、淋巴细胞功能分析 3、淋巴造血系统分化抗原及白血 第三节 流式细胞仪技术要求 病免疫分型 一、检测样品制备 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 二、常用的荧光染料与标记染色 五、AIDS病检测中的应用 三、胶乳颗粒的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原 四、流式细胞技术的质量控制 分析 七、移植免疫中的应用

流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧

流式细胞术

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vanta

分子生物学技术

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荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用

吴一峰H钱凯先

浙江大学生命科学学院H浙江杭州!’E%%$"(

摘

要C综述了流式细胞术在肿瘤研究过程中荧光探针的开发状况和选择利用@结合使用不同的荧光探针H采用双

色M三色乃至多色标记H流式细胞仪可以通过细胞膜抗原分析M细胞周期和N细胞凋亡分析等手段鉴AO倍体分析M

分型肿瘤细胞H监控肿瘤的发生和治疗过程@通过对不同荧光探针使用上的优势和局限的比较H提出了新一代定M

荧光探针开发方向的建议H以期改善流式细胞术在肿瘤细胞检测中精度和广度上的局限@关键词C流式细胞术P荧光探针P肿瘤中图分类号CQF"P"!R

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实验七 流式细胞仪检测技术

免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。

实验原理

流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和

Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACS Vantage 和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能