pcr问题分析
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PCR问题解析
如何防止PCR形成引物二聚体?
在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,对照marker时都不容易看出其大小,具体是什么原因呢?PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适?
答:1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的原因很多,如引物设计的不好,在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有达到最佳,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着改变一下循环数,也许会有帮助。
PCR模板大约在104-106个拷贝。
答2:我觉得是目的条带含量太多了,如果点样太多,负载量太大,就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量,稀释10倍或是减少循环数。
答3:1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法; 2. 可能模板有问题;PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致;
3. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
4. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的; 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%
PCR过程问题全解
如何防止PCR形成引物二聚体?
在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,对照marker时都不容易看出其大小,具体是什么原因呢?PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适?
答:1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的原因很多,如引物设计的不好,在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有达到最佳,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着改变一下循环数,也许会有帮助。
PCR模板大约在104-106个拷贝。
答2:我觉得是目的条带含量太多了,如果点样太多,负载量太大,就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量,稀释10倍或是减少循环数。
答3:1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法; 2. 可能模板有问题;PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致;
3. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
4. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的; 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的D
Realtime PCR溶解曲线分析
首先我们得来说说染料法SYBR Green的原理,SYBR Green能够结合在双链DNA上面的荧光染料,只有结合了双链DNA,才会发荧光,而游离的不会发光。 图1 SYBR Green原理 但是,染料没有选择特异性,就是只要有双链DNA,就会染上,并发荧光。 如果使用的引物产生了非特异性扩增,那么荧光强度就不是目的条带真实的强度,因此会产生严重偏差。融解曲线 我们如何判断本次qPCR扩增的都是目的片段呢?这就需要用到融解曲线。 在qPCR循环反应结束之后,系统会进行测定融解曲线,通常的方式就是从70度加热到90度,然后每隔一定时间(1s或者少于1s)测定系统荧光强度,随着温度的升高,dsDNA都解开双链,SYBR Green都游离之后不发荧光,荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线: 图2 融解曲线 然后我们运用医学中学到的高等数学C的求导,把荧光强度对温度求导,得出下图 图3 融解曲线的求导 为什么中间的峰那么高? dR/dT 越大,表明荧光值变化最快。随着温度上升,达到图中Tm点时,大部分扩增出来的双链DNA解开,荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异那么,融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR
荧光定量PCR问题疑难解答
荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总
荧光定量PCR问题疑难解答(一)
Q:1. 这两天我做标准曲线,线性关系还行,R平方0.998。但是扩增效率只有80%,另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料,样品的荧光强度也挺低的,只有100-200左右。
A:曲线不光滑有时跟染料的量相关,可以加大看看,或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差:引物,试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要,你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度,如果其他条件都好了,还不行,那就是引物的原因,那你就只能重新设计引物了。 2. PCR中混入影响反应的物质:
模板提取方法需要改进
3. 样品稀释不准确:
正常情况10倍比稀释时,前后是相差3.32个循环。 这很重要,做标准曲线很多不好的时候,很多都是倍比稀释的问题,
Q:荧光定量PCR的灵敏度
A:对于染料法的荧光定量来说,Ct值在13~30之间比较准确,30~33之间需要再次确认,在以上范围内的置信度比较差。
Q:标准曲线要重复两三次吗?
A:没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次,只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个,否则标准曲线准确性不高。
PCR-DGGE实验过程中常见问题的分析与改进
PCR-DGGE实验过程中
常见问题的分析与改进
刘丹,凌云
(上海海洋大学水产与生命学院,上海201306)
■■:对pcR.DIGGE实验过程中常见问题,如条带的有无、多少、拖尾、重影、扭曲、集中等问题进行了归纳总结,并提供了详细的解
决方法,如加强实验前仪器的检查;进行时间进程实验;选择适当的扩增引物、电泳温度和电流等。
关t词:PCR-DGGE;实验过程常见问题;分析;改进中圈分类号:Q78
文献标识码:A
1陀R—DGGE技术概述
变性梯度凝胶电泳(Denatured
GradientGelElectrophoresis)技术是
由Fischer和Lennan于1979年最先提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术,该技术可分辨出长度相同但序列不同的DNA片段。Muyzer等在1993年首次将DGGE技术应用于微生物群落结构的研究。现在,这项技术广泛应用于各个领域的微生物分子生态学研究中。特别是细菌和真菌序列多态性的DGGE技术,已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。
2
PCR—DGGE技术在实验过程中常见问晨的分析与改进
PCR-DGGE技术在运用过程中,常出现图谱分辨率和结果分析偏差等问题,其中无条带或条带过少、重影或拖尾、扭曲、集中于某
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR
荧光定量PCR技术 原理与结果 分析罗喜鹏
荧光定量PCR
一、含义 二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析
荧光定量PCR
一、含义 实时荧光定量PCR技术(Real-Time
Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加 入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。
荧光定量PCR
二、优越性
特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性,故与 传统的PCR相比,特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml,对数期分 析,线性范围很宽,为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中 病原体的数目为0-E10/拷贝,在此范围内荧光定量PCR定量 较为准确,标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定,因为域值设置在指数 扩增期.在此阶段,各反应组分浓度相对稳定,没有副作用, CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更 稳定,更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤,降低产物污染的风险性。
荧光定量PCR
三、应用 用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核
DMSO in PCR
1. 如果要增加特异性,要考虑是否升温,复性时候的较高温度有利于筛选特定片段,减少其他GC丰富片段的竞争。
2. 考虑使用甘油:加甘油也可以的,一般终浓度在10%左右.我的实验也曾遇到过GC高达73%的情况,加过甘油非特异性改善了很多,你不妨试一下.
3. 使用甜菜碱:
DMSO can usually give results in GC-rich regions when used at a final
concentration of 5%, although there are reports in the literature of
genes which required 10% DMSO, so a bit of experimentation may be
necessary to optimise the concentration for your genes. Alternatively,
addition of Betaine to concentrations of 1M in reactions can also be
beneficial in GC-rich regions.
There was a comparison pub
PCR步骤
RT-PCR实验步骤
一、总RNA提取
1)试剂配制
1. 0.1TPC水:1000mL双蒸水中加入1mLDEPC,室温下静置4小时。(①用来泡使用
器具处理12小时;②在120℃下高压灭菌30分钟后室温放置备用用来溶解RNA。) 2. 氯仿 3. 异丙醇
4. 75%乙醇:用无水乙醇和高压后的DPEC水配制,现配现用。
2)操作步骤:
1. 样品处理
a. 组织:将组织放在液氮中磨碎(低温处理)。每50-100mg组织加1mL裂解液TRZOL,
用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液TRZOL体积的十分之一。 b. 单层培养细胞;直接在培养板上加入裂解液TRZOL裂解细胞,每10cm2面积加1mL
TRZOL。用取样器抽打几次。(注意:裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定,不是由细胞数决定。如果加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染。)
c. 细胞悬液:离心取细胞,弃上清。每5-10×106动物细胞和植物细胞加入1mL裂解液RZ。
加裂解液RZ前不要洗涤细胞,以免降解RNA。
d. 血液:直接取新鲜血液,加入3倍体积RZ(推荐0.25mL血液+0.75mLRZ),充分震荡
混匀。
2. 将裂解样品在室温放置5分钟,使得核酸蛋白质复合
有关PCR习题
一、选出一个最符合题意的答案(最佳答案)。 1.以下哪种物质在PCR反应中不需要( )
A.Taq DNA聚合酶 B.dNTPs C.Mg2+ D.RNA酶 E.合适pH缓冲液 2.以下哪种酶可耐高温( )
A.Taq DNA聚合酶 B.Hind Ⅲ C.T4连接酶 D.RNA酶 E.Klenow片段 3.PCR反应正确过程应为( )
A.退火→变性→延伸 B.变性→退火→延伸 C.退火→延伸→变性 D.变性→延伸→退火E.延伸→变性→退火
4. PCR技术的本质是( )
A. 核酸杂交技术 B. 核酸重组技术C. 核酸扩增技术 D. 核酸变性技术 E. 核酸连接技术 5.Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为( )
A.37℃ B.50℃~55℃ C.70℃~75℃ D.80℃~85℃ E.94℃~95℃ 6.能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为( )
A.普通PCR仪 B.梯度PCR仪 C.原位PCR仪 D.荧光PCR仪 E.实时PCR仪 7.在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数( )
A.普通PCR仪 B.梯度PCR仪 C.原位PCR仪 D.荧光实时PCR仪E.定性PCR仪 8.
实时定量PCR中的常见问题及解决办法
对实时定量PCR实验中遇到的常见问题总结。
实时定量PCR中的常见问题及解决办法
1、反应后无扩增曲线出现
1)确认程序中是否设置了信号采集步骤:两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
2)扩增效率问题:电泳检测realtimePCR反应产物,观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有,则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。
3)循环数不够:一般可设置循环数为40。
2、Ct值出现太晚
1)模板浓度过低或模板降解:重新制备模板再进行实验。
2)扩增效率低:优化反应条件,或者重新设计PCR引物。
3)PCR产物过长:一般设计为100-200bp即可。
4)反应体系中含有抑制剂:常在模板质量不高时出现,重新制备模板或将模板稀释后使用。
3、扩增曲线形状异常
1)扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
2)扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4),重新分析数据。
3)个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
4、阴性对照出现扩增曲线
1)阴