pcr问题分析

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的； 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的； 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的D

首先我们得来说说染料法SYBR Green的原理，SYBR Green能够结合在双链DNA上面的荧光染料，只有结合了双链DNA，才会发荧光，而游离的不会发光。 图1 SYBR Green原理 但是，染料没有选择特异性，就是只要有双链DNA，就会染上，并发荧光。 如果使用的引物产生了非特异性扩增，那么荧光强度就不是目的条带真实的强度，因此会产生严重偏差。融解曲线 我们如何判断本次qPCR扩增的都是目的片段呢？这就需要用到融解曲线。 在qPCR循环反应结束之后，系统会进行测定融解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一定时间（1s或者少于1s）测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBR Green都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线： 图2 融解曲线 然后我们运用医学中学到的高等数学C的求导，把荧光强度对温度求导，得出下图 图3 融解曲线的求导 为什么中间的峰那么高？ dR/dT 越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升，达到图中Tm点时，大部分扩增出来的双链DNA解开，荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR

荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

荧光定量PCR问题疑难解答（一）

Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。

1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。

做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。 2. PCR中混入影响反应的物质：

模板提取方法需要改进

3. 样品稀释不准确：

正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。 这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，

Q：荧光定量PCR的灵敏度

A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。

Q：标准曲线要重复两三次吗?

A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ实验过程中

常见问题的分析与改进

刘丹，凌云

（上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６）

■■：对ｐｃＲ．ＤＩＧＧＥ实验过程中常见问题，如条带的有无、多少、拖尾、重影、扭曲、集中等问题进行了归纳总结，并提供了详细的解

决方法，如加强实验前仪器的检查；进行时间进程实验；选择适当的扩增引物、电泳温度和电流等。

关ｔ词：ＰＣＲ－ＤＧＧＥ；实验过程常见问题；分析；改进中圈分类号：Ｑ７８

文献标识码：Ａ

１陀Ｒ—ＤＧＧＥ技术概述

变性梯度凝胶电泳（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ

ＧｒａｄｉｅｎｔＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）技术是

由Ｆｉｓｃｈｅｒ和Ｌｅｎｎａｎ于１９７９年最先提出的一种用于检测ＤＮＡ突变的电泳技术，该技术可分辨出长度相同但序列不同的ＤＮＡ片段。Ｍｕｙｚｅｒ等在１９９３年首次将ＤＧＧＥ技术应用于微生物群落结构的研究。现在，这项技术广泛应用于各个领域的微生物分子生态学研究中。特别是细菌和真菌序列多态性的ＤＧＧＥ技术，已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

２

ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术在实验过程中常见问晨的分析与改进

ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在运用过程中，常出现图谱分辨率和结果分析偏差等问题，其中无条带或条带过少、重影或拖尾、扭曲、集中于某

荧光定量PCR

荧光定量PCR技术 原理与结果 分析罗喜鹏

荧光定量PCR

一、含义 二、优越性 三、应用 四、定量方法 五、荧光材料 六、结果分析

荧光定量PCR

一、含义 实时荧光定量PCR技术(Real-Time

Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加 入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。

荧光定量PCR

二、优越性

特异性 荧光定量PCR具有引物和探针的双重特异性，故与 传统的PCR相比，特异性大为提高。 敏感性 荧光定量PCR的敏感度通常达E2拷贝/ml,对数期分 析，线性范围很宽，为0-E11拷贝/ml。一般来讲临床标本中 病原体的数目为0-E10/拷贝，在此范围内荧光定量PCR定量 较为准确，标本不需稀释。 重复性 荧光定量PCR结果相当稳定，因为域值设置在指数 扩增期.在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用， CT与荧光信号的对数呈线性关系。与终点法相比CT值能更 稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。 自动化 无PCR后续操作步骤，降低产物污染的风险性。

荧光定量PCR

三、应用 用于核酸的定量如RNA、DNA的定量 用于核

1. 如果要增加特异性，要考虑是否升温，复性时候的较高温度有利于筛选特定片段，减少其他GC丰富片段的竞争。

2. 考虑使用甘油：加甘油也可以的,一般终浓度在10%左右.我的实验也曾遇到过GC高达73%的情况,加过甘油非特异性改善了很多,你不妨试一下.

3. 使用甜菜碱：

DMSO can usually give results in GC-rich regions when used at a final

concentration of 5%, although there are reports in the literature of

genes which required 10% DMSO, so a bit of experimentation may be

necessary to optimise the concentration for your genes. Alternatively,

addition of Betaine to concentrations of 1M in reactions can also be

beneficial in GC-rich regions.

There was a comparison pub

RT-PCR实验步骤

一、总RNA提取

1）试剂配制

1. 0.1TPC水：1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，室温下静置4小时。（①用来泡使用

器具处理12小时；②在120℃下高压灭菌30分钟后室温放置备用用来溶解RNA。） 2. 氯仿 3. 异丙醇

4. 75%乙醇：用无水乙醇和高压后的DPEC水配制，现配现用。

2）操作步骤：

1. 样品处理

a. 组织：将组织放在液氮中磨碎（低温处理）。每50-100mg组织加1mL裂解液TRZOL，

用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液TRZOL体积的十分之一。 b. 单层培养细胞；直接在培养板上加入裂解液TRZOL裂解细胞，每10cm2面积加1mL

TRZOL。用取样器抽打几次。（注意：裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。）

c. 细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每5-10×106动物细胞和植物细胞加入1mL裂解液RZ。

加裂解液RZ前不要洗涤细胞，以免降解RNA。

d. 血液：直接取新鲜血液，加入3倍体积RZ（推荐0.25mL血液+0.75mLRZ），充分震荡

混匀。

2. 将裂解样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白质复合

一、选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（ ）

A．Taq DNA聚合酶 B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶 E．合适pH缓冲液 2．以下哪种酶可耐高温（ ）

A．Taq DNA聚合酶 B．Hind Ⅲ C．T4连接酶 D．RNA酶 E．Klenow片段 3．PCR反应正确过程应为（ ）

A．退火→变性→延伸 B．变性→退火→延伸 C．退火→延伸→变性 D．变性→延伸→退火E．延伸→变性→退火

4． PCR技术的本质是（ ）

A． 核酸杂交技术 B． 核酸重组技术C． 核酸扩增技术 D． 核酸变性技术 E． 核酸连接技术 5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（ ）

A．37℃ B．50℃～55℃ C．70℃～75℃ D．80℃～85℃ E．94℃～95℃ 6．能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为（ ）

A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光PCR仪 E．实时PCR仪 7．在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数（ ）

A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光实时PCR仪E．定性PCR仪 8．

对实时定量PCR实验中遇到的常见问题总结。

实时定量PCR中的常见问题及解决办法

1、反应后无扩增曲线出现

1）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

2）扩增效率问题：电泳检测realtimePCR反应产物，观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有，则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。

3）循环数不够：一般可设置循环数为40。

2、Ct值出现太晚

1）模板浓度过低或模板降解：重新制备模板再进行实验。

2）扩增效率低：优化反应条件，或者重新设计PCR引物。

3）PCR产物过长：一般设计为100-200bp即可。

4）反应体系中含有抑制剂：常在模板质量不高时出现，重新制备模板或将模板稀释后使用。

3、扩增曲线形状异常

1）扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

2）扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4)，重新分析数据。

3）个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

4、阴性对照出现扩增曲线

1）阴