植物呼吸酶的简易测定

植物呼吸酶的测定

植物体内的呼吸酶，是催化植物在呼吸过程中，进行氧化还原的一些酶类。植物体内的末端氧化酶是将从基质传递来的电子，直接交给氧并产生H2O或H2O2。植物体内的末端氧化酶有抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。这个复杂的氧化酶系统，有助于植物对不良外界环境条件的适应。

通过本实验，掌握一个简便快速测定抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的方法---滴定法测定抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性。 [实验原理]

1.抗坏血酸氧化酶活性的测定

抗坏血酸在抗坏血酸氧化酶的作用下，可以氧化为脱氢抗坏血酸。

抗坏血酸每抗坏血酸?1/2O2?????脱氢抗坏血酸

以抗坏血酸为底物，加入酶的提取液，酶与底物充分反应，此时抗坏血酸氧化酶将抗坏血酸消耗掉一部分，根据消耗的多少来计算酶的活性。抗坏血酸消耗的多，说明酶的活性强。

抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。 I2的产生：KIO3+5KI+6HPO3→3I2+6KPO3+3H2O 用碘液滴定剩余的抗坏血酸：

抗坏血酸氧化酶抗坏血酸?I2???????脱氢抗坏血酸

2.多酚氧化酶活性的测定

多酚氧化酶在有氧存在的条件下，可以将酚氧化成醌，其反应如

下：

邻苯二酚?1/2O2?多酚氧化酶????邻醌

邻醌

实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修）

[目的与原理]

掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。

血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。 [试剂与器材] 试剂：

1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。

2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。 3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。 器材：

721分光光度计 , 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管 16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。 [实验步骤]

1、样品测定：基质液置于37℃水浴 5 min，然后按下列步骤操作 试剂 基质液 钼酸铵 缓冲液 血清

对照管 1.0

准确称取天山云杉种子0.1 g，先加入 1 ml 预冷的50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含1 mmol/ L EDTA)，研磨成匀浆，然后用 4.5 ml 分两次冲洗研钵至试管中，4 ℃，10000 r/min 离心 20 min，上清液即为酶提取液，4 ℃保存用于ROS系统酶活性分析。 3 酶活性的测定

3.1 过氧化物酶 (POD，EC 1.11.1.7) 活性的测定。

按照 Chance 和 Maehly[6]的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含 0.1 mmol/ L EDTA) 2.9 mL，2 % H2O2 1.0 mL，50 mmol/ L 愈创木酚1.0 mL。测定时，反应混合液先在 25 ℃ 水浴中预热，立即加入0.1 mL酶液以启动反应，以缓冲液调零，测定OD470值，每隔 30 s读数一次。取 0 — 60 s 时间段，即 1 min 反应时间来计算酶活性。以每分钟OD470增加0.01的酶量为一个酶活单位，U·g-1。

计算公式: POD活性 = ΔA470 × Vt × (0.01× t × FW × V1) -1 注: ΔA470:反应时间内

一、脲酶测定(比色法)

1、试剂配制：

（1） pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化

钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2） 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后

用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。 （4） 10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5） N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN

的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤

称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量

脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定

已证明高等植物体内存在2条脯氨酸合成途径，根据初始底物的不同分别命名为谷氨酸途径和鸟氨酸途径。谷氨酸（Glu） 是前者的初始底物，鸟氨酸（Orn）是后者的底物。在植物中，谷氨酸途径认为谷氨酸通过两步连续的还原合成脯氨酸，Δ-吡咯啉-5-羧酸（P5C）为中间产物；催化反应的酶为P5C合成酶（P5CS）和P5C还原酶（P5CR）。鸟氨酸途径中GSA是由转氨基作用生成的，后生成P5C，最终被P5CR还原成脯氨酸。Delauney等人认为，在渗透胁迫条件下，P5CSmRNA和δ-OATmRNA表达与植物体内的氮素水平有关，在渗透胁迫和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位，而在非胁迫及高氮条件下鸟氨酸又居于主导地位。

调控植物体内脯氨酸含量高低的另一主要因素是脯氨酸的降解与代谢，降解过程基本是合成途径的逆过程，脯氨酸在线粒体中，通过脯氨酸脱氢酶（ProDH）和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH）的作用生成谷氨酸。

植物脯氨酸合成和降解有关的酶

Δ-二氢吡咯-5-羧酸合成酶（P5C synthetase，P5CS）和P5CR是谷氨酸途径中的两个关键酶，其中P5CS催化第一步反应，P5CR催化最后一步反应，第一步反应为限速反

脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定

已证明高等植物体内存在2条脯氨酸合成途径，根据初始底物的不同分别命名为谷氨酸途径和鸟氨酸途径。谷氨酸（Glu） 是前者的初始底物，鸟氨酸（Orn）是后者的底物。在植物中，谷氨酸途径认为谷氨酸通过两步连续的还原合成脯氨酸，Δ-吡咯啉-5-羧酸（P5C）为中间产物；催化反应的酶为P5C合成酶（P5CS）和P5C还原酶（P5CR）。鸟氨酸途径中GSA是由转氨基作用生成的，后生成P5C，最终被P5CR还原成脯氨酸。Delauney等人认为，在渗透胁迫条件下，P5CSmRNA和δ-OATmRNA表达与植物体内的氮素水平有关，在渗透胁迫和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位，而在非胁迫及高氮条件下鸟氨酸又居于主导地位。

调控植物体内脯氨酸含量高低的另一主要因素是脯氨酸的降解与代谢，降解过程基本是合成途径的逆过程，脯氨酸在线粒体中，通过脯氨酸脱氢酶（ProDH）和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH）的作用生成谷氨酸。

植物脯氨酸合成和降解有关的酶

Δ-二氢吡咯-5-羧酸合成酶（P5C synthetase，P5CS）和P5CR是谷氨酸途径中的两个关键酶，其中P5CS催化第一步反应，P5CR催化最后一步反应，第一步反应为限速反

简易呼吸器的使用

简易呼吸器是最简单的借助气械加压的人工呼吸装置，具有使用方便，痛

苦轻，并发症少，便于携带，有无氧源均可立即通气的特点。在临床急救及转运

过程中采用简易呼吸器辅助呼吸，改善了患者的呼吸功能，有效的纠正了低氧血

症，大大地提高了抢救成功率。

简易呼吸器的构造：

面罩、呼吸囊、呼吸活瓣、衔接管、氧气连接管、储气袋、及固定带。

适应症：

1. 各种原因所致的呼吸停止或呼吸衰竭的抢救及麻醉期间的呼吸管理。

2. 运送病员 适用于机械通气患者作特殊检查，进出手术室等情况。 3. 临时替代呼吸机 遇到呼吸机因故障、停电等特殊情况时，可临时应用简易 呼吸器替代。

4. 心肺复苏。

禁忌症：

1. 未经减压及引流的张力性气胸，纵隔气肿。

2. 中等量以上的咯血。

3. 重度肺囊肿或肺大泡。

4. 低血容量性休克未补充血容量之前。

5. 急性心肌梗死。

6. 严重误吸引起的窒息性呼吸衰竭。

目的：

1. 维持和增加机体通气量。

2. 纠正威胁生命的低氧血症。

工作原理：

1. 当挤压球体时，产生正压，将进气阀关闭，内部气体强制性推动鸭嘴阀打开，

并堵住出气阀，球体内气体即由鸭嘴阀中心切口送向病人。如用氧气，则氧气随

球体复原吸气动作暂存于球体内，在挤

一、实验目的和要求

掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐

还原为亚硝酸盐：

--

产生的NO2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO2含量的增加，即表示该酶活性的大小。

装 NO2含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰

-

订线

胺）反应产生重氮，再与α–萘胺（或萘基乙烯二胺）偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。 三、主要仪器设备

1、实验仪器 分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液

3、实验材料 在15-25℃ 蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。

四、操作方法和实验步骤

1、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.

实验六 乳酸脱氢酶酶活力测定 及紫外吸收法测定蛋白质含量

目的要求

(1) 掌握LDH活性测定原理；

(2) 学习用比色法测定酶活性的方法。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为

简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。

利用上述原理，改变不同第五则可测定相应脱氢酶反应过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢

*33*年第"-期中国饲料

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纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

"

!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

-*"型分光光度计、

恒温水浴锅、./0%*酸度计、

秒表。")")1

试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678

磷酸氢二钠液（称取-)