激光扫描共聚焦显微镜原理

激光扫描共聚焦显微镜技术

Laser Scanning Confocal Microscope

——基础篇 李治国

细胞的内在生活 显微镜的发展史

没有显微镜就不可能有细胞学诞生。

1590年，荷兰眼镜制造商J和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜。

1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓)，命名为cella。

1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。

Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723). Magnification ranges at 50-275x. 显微镜的最重要参数 ——分辨力

显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关。

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 各种显微镜的分辨能力

光学显微镜（light microscopy）0.2μm

电子显微镜 (Electro microscopy) 0.2nm

激光共聚焦扫描显微镜操作规程

一．

开机程序

1．开启总电源，确认所有仪器电源状态正常工作

2．开启电脑，双击桌面上的LSM510图标，开启显微镜。 3．在初始平面上点击Start Expert Mode 键开启专家拍摄模式。 4．在主菜单中点击File New键，建立新的数据库。 二．

软件拍摄

1．在主菜单上点击Acquire Laser键，开启需要使用的激光 2．在主菜单上点击VIS键，开启显微镜观察模式 3．把需要观察的玻片放到载物台上选择需要观察的平面 4．在主菜单上点击LSM键，开启进入显微镜激光扫描模式 5．在主菜单上点击Config键，选择所需要扫描的模式及参数 6．在主菜单上点击Scan Find键，进行图像参数自动校正 7．在Scan子菜单下点击Fast X键，进行层面选择

8．在连续扫描中调节放大器增益、补偿；激光强度等图像参数来优化图像 9．点击图像子菜单上的Save键存储优化好的图像 三．

关机程序

1．完成所有操作后，关掉激光开关，冷却5分钟后，点击主菜单上Exit键，退出所有程序 2．关闭电脑 3．关闭电源

ZEISS 510 META二维扫描程序

1. 在Acquire → config → 确定扫描所需的波

为适应三维光学微细加工及三维光学信息存储研究的需要,研制了共聚焦激光扫描荧光显微镜的工作台式扫描系统,扫描范围138μm×138μm。

第10卷　第6期2002年12月

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Dec.　2002OpticsandPrecisionEngineering

光学　精密工程

Vol.10　No.6

文章编号　1004-924X(2002)06-0582-06

共聚焦激光扫描荧光显微镜扫描系统研制

周拥军,陈德强,黄文浩,夏安东

1

1

1

1,2

(1.中国科学技术大学精密机械及精密仪器系,安徽合肥230026;

2.中国科学院化学所分子反应动力学实验室,北京100800)

摘要:为适应三维光学微细加工及三维光学信息存储研究的需要,研制了共聚焦激光扫描荧光显微镜的

工作台式扫描系统,扫描范围138μm×138μm。工作台采用压电陶瓷驱动器(PZTactuator)驱动的方式来获得高分辨率的位移,采用带柔性铰链的杠杆放大装置来获得较大的位移范围。描述了工作台的工作原理,并对其静态和动态性能进行了测试,实验表明这一扫描系统能很好的应用于共聚焦激光扫描荧光显微镜系统。关　键　词:共焦显微镜;压电陶瓷驱动器;柔性铰链中图分类号:TH742.64

胰腺细胞悬浮液样品 适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为

1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。

Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

方法：

1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic

F-127备用。

2.移去培养皿中的原培养液，用

胰腺细胞悬浮液样品 适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为

1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。

Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

方法：

1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic

F-127备用。

2.移去培养皿中的原培养液，用

激光共聚焦显微镜的原理与应用范围

激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和 装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。

1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理

从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:

1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。

1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差

1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源 逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密

STM的原理及其应用

摘要：近年来，人类在纳米科技领域内的研究取得了引人瞩目的成就。而扫描隧道显微镜（STM）是纳米科技发展的重要基础。STM系统的出现首次成功实现了对原子实际空间图像的观察，促进了人类对微观领域的认知，推动了纳米科技的发展。本文主要介绍了STM的原理、系统结构极其应用。

1 扫描隧道显微镜（STM）的概述[1,2,3]

1.1 扫描隧道显微镜（STM）的发展

1982年，国际商业机器公司苏黎世实验室的葛·宾尼（Gerd Binnig）博士和海·罗雷尔（Heinrich Rohrer）博士及其同事们共同研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器——扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope,以下简称 STM）。它的出现，使人类第一次能够实时地观察单个原子 在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学 性质，在表面科学、材料科学、生命科学等领域的研究中有着重大的意义和广阔的应用前景，被国际科学界公认为八十年代世界十大科技成就之一，为表彰STM的发明者们对科学研究的杰出贡献，1986年宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖。而在1988年，白春礼成功研制了国内第一台计算机控制、有数据分析和图像处理系统

本实验主要学习扫描隧道显微镜的工作原理,了解STM的基本仪器结构,掌握用电化学腐蚀方法制作STM探针,熟悉STM的数据采集并获取石墨的原子分辨像,分析所得扫描图像计算x、y方向压电陶瓷的电压灵敏度

扫描隧道显微镜（STM）的原理和应用

【摘要】：

本实验主要学习扫描隧道显微镜的工作原理，了解STM的基本仪器结构，掌握用电化学腐蚀方法制作STM探针，熟悉STM的数据采集并获取石墨的原子分辨像，分析所得扫描图像计算x、y方向压电陶瓷的电压灵敏度分别为14.53

15.6。 、关键词：

扫描隧道显微镜 隧道效应 石墨晶体

一、实验引言：

随着材料科学的不断进步，人们能够复制改良设计合成很多种材料。为了能够探测到一些材料的表面形态，在20世纪80年代基于量子隧道效应，IBM公司的Binning博士、Rohrer博士及其同事研制成功了扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscopy，简称STM）。两位发明者因此于1986年获得诺贝尔物理学奖。STM技术的诞生使在纳米尺度范围探测材料的表面特性成为可能，这是因为STM 能够一个原子一个原子地将表面的几何结构和电子结构联系起来，实时地观察单个原子在物质表面的排列状态及与表面电子行为有关的物理

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（一）显微镜 1 显微镜的结构识别

2显微镜的使用步骤 （1）取镜和安放

[1]右手握住镜臂，左手托住镜座。

[2]把显微镜放在实验台距边缘7 cm左右处,略偏左,安装好目镜和物镜。 （2）对光

[3]转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。要使物镜前端与载物台保持2 cm的距离。

[4]把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜，右眼睁开。转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜可以看到白亮的圆形视野。 （3）观察

[5]把所要观察的玻片标本放在载物台上，用压片夹压住，玻片标本要正对通光孔的中心。

[6]顺时针转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（此时眼睛一定要看着物镜）。 [7]用左眼向目镜内看，同时逆时针方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升直到看清物像为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。 [8]练习将所观察的标本移到视野中央。 （4）实验完毕

[9] 用擦镜纸将目镜和物镜擦拭干净；

转动转换器，把两个物镜偏到两旁，并将镜筒缓缓下降到最低处。 最后把显微镜放进镜箱里，送回原处。 注： ①

扫描电子显微镜的应用及其发展

1前言

扫描电子显微镜SEM(Scanning Electron Microscopy)是应用最为广泛的微观形貌观察工具。其观察结果真实可靠、变形性小、样品处理时的方便易行。其发展进步对材料的准确分析有着决定性作用。配备上X射线能量分辨装置EDS (Energy Dispersive Spectroscopy)后，就能在观察微观形貌的同时检测不同形貌特征处的元素成分差异,而背散射扫描电镜EBSD（Electron Backscattered Diffraction）也被广泛应用于物相鉴定等。

2扫描电镜的特点

形貌分析的各种技术中，扫描电镜的主要优势在于高的分辨率。现代先进的扫描电镜的分辨率已经达到1纳米左右；有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构试样制备简单；配有X射线能谱仪装置，这样可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析[1]。低加速电压、低真空、环境扫描电镜和电子背散射花样分析仪的使用，大大提高了扫描电子显微镜的综合、在线分析能力；试样制备简单。直接粘附在铜座上即可，必要时需蒸Au或是C。

扫描电镜也有其局限性