酵母菌是真核还是原核

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酵母菌DNA

标签:文库时间:2025-02-01
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采用3种方法对不同酵母菌的总DNA进行提取,经琼脂糖凝胶电泳、ND-1000型微量紫外分光光度计检测以及酶切、连接、预扩增试验结果的分析,表明采用改良氯化苄法提取酵母菌的总DNA质量最好,基本无DNA碎带,蛋白质污染小。通过对野生酵母菌菌株的验证试验,进一步证明采用改良氯化苄法提取的总DNA产量稳定、重复性好,可以直接用于限制性内切酶酶切试验,完全适于AFLP分析及一些其它分子生物学研究的要求方法三:酵母菌genomics/\基因组DNA的提取

一:仪器:同方法一

二:试剂:SE缓冲液(1M山梨醇,0.1MEDTA pH7.5);溶菌酶(蛋白酶K缓冲液(10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA);其余同前

三:操作

1.5ml 对数生长期细菌细胞

离心,12000rpm,1-2min

沉淀

溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr

离心,12000rpm,8-10min

沉淀

溶于100μL,0.5μl蛋白酶K,混匀,37℃,1hr

加入1.2ml的CTAB

酵母菌DNA的提取

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酵母DNA提取方法

方法一:

石英砂法

1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体(5ml左右),于 200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中,加入 3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡 13min,每隔 4min 将离心管取出用力甩几下,然后 65℃水浴 10min。 2、加入 200μL 5mol/L KAc,冰浴 8min; 3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中;

4、加入 3 mol/L NaAc 35μl,加入异丙醇 200μL混匀后冰浴 8min,12000rpm×5min收集沉淀;

5、200μL TE 溶解,加入 RNase10μL,65℃水浴 10min; 6、加入 200μL 氯仿-异戊醇(24:1),抽提;

7、温柔地取上清 150μL ,加入 20μL 3 mol/L NaAc 及 375μL 无水乙醇,混匀后12000rpm×8min 收集 DNA;

8、70% 乙醇洗涤沉淀,吹干后 TE 溶解,-20℃保藏。

方法二:

蜗牛酶法

1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在

利用酵母菌生产蛋白质

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《生命科学文献与论文写作》课程论文

利用酵母菌生产蛋白质

摘要:蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中,起着十分重要的作用,是生命机体几乎所有重要活动的承担者。酵母菌应用于生物领域由来以久。6000年来人们用这种微小的真菌制作面包、啤酒和酒。现今用于直接治疗疾病的人类蛋白质的生产,已经成为一个每年有着190亿美元产值的产业。但是这种生物大分子目前却不能大批量的生产。它们大都是费时费力的从培养皿中培养的动物(如中国仓鼠)细胞分泌提取的。基因工程研究人员发现了一种用低等的酵母菌来生产人类蛋白质的新技术。这种技术开辟了一条大量生产生物药品的新途径。酵母菌能够用来生产复杂的人类糖蛋白,这种技术对于治疗用人类蛋白的生产有着革命性的意义。更好、更便宜、更快、更安全,并提供了一个对产品的最终质量进行控制的手段。作为宿主的酵母最常用的是毕赤氏酵母和酿酒酵母。 关键词:酵母菌;生产;蛋白质

Production of proteins using the yeast

Abstract: Protein in cells and organisms of biological processes, play an important role in almost

常见真核启动子及原核启动子特点

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真核启动子

RNA转主要用途 录本 启动子 描述 表达 备注 CMV 常规表达用 人类巨细胞病毒来mRNA 源的强哺乳动物表达启动子 组成型 可能包含一个增强子,在某些细胞中会沉默 EF1a

常规表达用

人延长因子1α来源

mRNA

的强哺乳动物表达启动子

组成型

表达水平十分稳定,与细胞类型无关

SV40 常规表达用 猿猴空泡病毒40来mRNA 源的哺乳动物表达启动子 组成型 可能包含一个增强子 PGK1 (人/小鼠)

常规表达用

磷酸甘油酸酯激酶

mRNA

基因来源的哺乳动物启动子

组成型

广泛表达,但可能因细胞类型而异。由于甲基化或脱乙酰作用,倾向于抵抗启动子下调。

Ubc 常规表达用 人类泛素C基因来mRNA 源的哺乳动物启动子 组成型 顾名思义,该启动子无处不在 human beta actin

常规表达用

β-肌动蛋白基因来

mRNA

源的哺乳动物启动子

组成型

无处不在,鸡的启动子常用与启动子杂交

CAG 常规表达用 mRNA 强杂交哺乳动物启动子 组成型 包含CMV的增强子,鸡的beta actin启动子和兔的beta-globin剪接受体 TRE

常规表达用

mRNA

四环素响应元件启动子

被四环素或

者类似

原核诱导表达

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原核诱导表达的标准操作程序(SOP) 一.目的:

使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程,并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二.适用范围:

本SOP适用于对新基因克隆的表达,并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三.实验原理:

E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录

原核表达综述

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[Merck推荐]原核表达秘笈之宿主菌株选择指南

在原核蛋白表达过程中,选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素:表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。 事实上,在平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因——即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。

作为原核表达的宿主,对外源基因的表达会产生一定的影响,是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂,按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的,当出现问题时,我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?

知其然还要知其所以然。比如,菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。

真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同

原核诱导表达

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原核诱导表达的标准操作程序(SOP) 一.目的:

使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程,并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二.适用范围:

本SOP适用于对新基因克隆的表达,并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三.实验原理:

E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录

利用重组酵母菌生产人胰岛素

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利用重组酵母菌生产人胰岛素

摘要:利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程:获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建,根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子, 采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒,构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319,用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株,经过营养筛选和PCR 复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产,通过补料-分批发酵获得发酵液,分离纯化后获得人胰岛素。纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测,氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。

关键词:重组酵母;人胰岛素;发酵;纯化;鉴定

Using recombinant yeast to produce human insulin

HuSheng 1142043040

Abstract:The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as foll

微生物实验7 酵母菌 - 图文

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微生物实验报告

酵母菌的培养及观察实验

刘欣怡201100140057

生物科学基地班

组别:周一下午三组

同组者:曹平平,周楠,

刘艺,刘希伟

实验完成时间:2012年11月19号

一、实验目的

1、了解酵母菌的形态及出芽方式 2、学习区分酵母菌的死细胞和活细胞 3、掌握酵母菌子囊孢子的观察方法 4、巩固显微镜操作技术和无菌操作技术

二、实验器材

1.菌种 :

酿酒酵母7d麦氏培琼脂(产孢培养基)斜面培养物,酿酒酵母2d YPD(酵母合成培养基)液体培养物。 2. 培养基 :

酵母合成培养基,麦氏琼脂斜面 3、试剂:

0.01%美蓝水溶液,5%孔雀绿水溶液,0.5%番红水溶液,95%乙醇,蒸馏水、香柏油、去离子水等。 4. 仪器

试管,锥形瓶,酒精灯,显微镜,擦镜纸,酒精灯,载玻片,盖玻片,双层瓶,接种环,滴管,滤纸,镊子、培养皿等。

三、实验原理

1、培养基:

酵母菌的能源主要是糖,一般用麦芽汁琼脂培养基培养。但实验要求不是很严格时,可以用

原核表达详细步骤

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原核:(1)、要构建一个合适的原核表达载体的基本要求:

①有一个强的启动子及其两侧的调控序列; ②有SD序列及SD序列与起始密码子之间要有

合适的距离; ③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架; ④外源基因下游加入不依赖ρ因子的转录终止区。(2)、编码基因要完整,没有插入序列;(3)、将真核基因克隆到原核基因中,以保证产物表达的稳定性;(4)、克隆基因中保留信号肽序列,使表达产物自细菌分泌到溶液中,有利于产物的分离纯化。 表达详细步骤

PartⅠ选择表达的目的基因

一、 基因序列

1. 得到靶基因DNA(cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序:

① 利用生物信息学在NCBI上blast同源基因,找到同源蛋白,再在DNA的ORF中找到正确的读码。

② 实验方法,即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。 ③ 利用mRNA的特征,找到启动子,编码区,终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA)。 2. 注意事项:

①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义,寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子;CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS和part