细胞冻存与复苏过程影响细胞活力的因素有那些?

细胞冻存与复苏

细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存 【用品】

（1） 5%胰蛋白酶

（2） 含10%~20%血清培养液

（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒） （4） 吸管、离心管、冻存管 【步骤】

（1） 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

（2） 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3） 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4） 装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。

细胞的冻存

细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存！！！ 一 材料：

生长良好之培养细胞，新鲜培养基，DMSO，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。

二步骤：

2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形，最好细胞应该处于对数生长期。 2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5–10％，混合均匀，置于室温下待用。避免因临时配制产热而伤害细胞。

2.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 mL)计数细胞浓度。

2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.5 接着置于–20℃冰箱，约30–60min。20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入–80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 2.6. 置于–80超低温冰箱中放置过夜。 2.7. 置于液氮罐中长期保存。

2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔

甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

【摘 要】目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法 本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂，以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。 结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性，即在一定比例的冷冻剂保护下，细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂，无论是DMSO，还是甘油，其比例只有在10%-15%之间，细胞复苏后的成活率才达到最佳状态，即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。

【关键词】DMSO；甘油；Vero细胞；细胞冻存

细胞培养是研究活组织和活细胞的良好方法。长期传代势必会影响细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，也会造成资源浪费[1]。目前最常用的细胞冻存剂是DMSO和甘油，因此本实验主要研究这两种冷冻保护剂对细胞冻存效果的比较。本研究以DMEM为细胞培养液， 以DMSO或甘油作为冷冻保护剂，并添加胎牛血清组成冷冻保护液[2-3]，通过两种冻存液的不同配方及其不同配比对细胞冻存效果的比较采取最佳冷冻保护剂的比例将细胞冻存，为以后的工作提供更多便利，同时也节省了大

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影响细胞呼吸的因素

影响呼吸作用的因素有温度、氧气浓度、二氧化碳浓度、含水量等，其中主要是温度。现在简单谈谈这些因素的影响及其在生产实践中的应用。

1. 温度

呼吸作用在最适温度（25℃~35℃）时最强；超过最适温度，呼吸酶活性降低甚至变性失活，呼吸作用受抑制；低于最适温度，酶活性下降，呼吸作用受抑制。

生产上常利用这一原理在低温下储存蔬菜、水果。在大棚蔬菜的栽培过程中夜间适当降温，抑制呼吸作用，减少有机物的消耗，可达到提高产量的目的。

2. 氧气浓度

在氧气浓度为零时，只进行无氧呼吸；氧气浓度为10%以下时，既进行有氧呼吸，又进行无氧呼吸；氧气浓度为10%以上时，只进行有氧呼吸。

生活中常利用降低氧气浓度能抑制呼吸作用，减少有机物消耗这一原理来延长蔬菜水果的保鲜时间。但是，在完全无氧的情况下，无氧呼吸强，分解的有机物也较多，一样不利于蔬菜水果的保质、保鲜，所以一般采用低氧（5%）保存，此时有氧呼吸较弱，而无氧呼吸又受到抑制。

无土栽培通入空气，农耕松土等都是为了增加氧气的含量，加强根部的有氧呼吸，保证能量供应，促进矿质元素的吸收。

3. 二氧化碳浓度

Word 文档

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CO2是呼吸作用产生的，从化学平衡角度分析，CO2浓度增加，呼吸速率下降。

在密闭的地窖中，氧

细胞培养基及冻存液的配制

细胞培养基的配制： 注意事项：为了避免不小心污染造成的浪费，一般用50ml管分装配制。 配置比例：45ml 培养基（90%的总体积比例）+ 5ml FBS（血清，10%的总体积比例）+ 500μL 双抗（1:100的比例） 双抗：链霉素+青霉素——抑制细菌生长。

细胞冻存液的配制： 配置比例：5mlDMSO（100%纯度，以10%总体积的比例）+ 45ml已配好的培养基（90%的总体积比例）

注意事项：刚配好的细胞冻存液会发热，需用封口膜封住瓶盖后（防止细菌污染）放入冰箱冷冻后再使用。过热的冻存液会使得细胞死亡？？ 冻存液一般提前一天配好即可，放置太久会

DMSO二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide）：是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，因其抗冻作用，可用于细胞的冻存；

细胞冻存

操作步骤： 1、打开水浴锅，将培养基和冻存液用封口胶封好加热至37℃。

2、用酒精喷壶消毒（手及洁净工作台表面，进入工作台为防止污染均需酒精喷

壶消毒）；从培养箱中取出要冻存细胞的培养皿。

3、用移液管吸出培养基，弃至废液缸（注意移液管勿碰到废液缸壁或其他物品，

避免污染；移液管用完后倒

围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结

实验一：细胞传代培养

材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10?S的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等

步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）

1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10?S的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。

3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。

4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。

5、弃上清液，加入少量10?S的1640培养基使成细胞悬液。

6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆

影响网站权重的因素有哪些

(1)相对于域名的自然权重,域名本身是有价值的，域名的价值分为两个部分，一是域名的后缀，一般来说，gov和edu的后缀，权重比较高，因为他们分别代表了GVM和教育行业，不是一般的个人用户所能够注册的，信息的权威性、真实性也比较高，所以受到搜索的重视。域名后缀依次为：.gov、.edu、.org、.com、.net、.cn、。域名注册的时间越早，相对于域名权重就越高。域名的因素比较小，普通的网站几乎不用考虑。

(2)网站服务器:网站要采用稳定服务器，确保在搜索引擎蜘蛛抓取时能正常访问。一个经常打不开的网站，在搜索引擎中的眼中，不会是一个好网站。甚至说网站的打开速度都是一个重要问题。服务器的安全，服务器不要因为被heike攻击而感染，而影响网站的正常访问。服务器最好采用独立的IP，只放置一个网站，可以提高网站权重。而且不会因为服务器放置了搜索引擎不喜欢的站，而影响网站的权重。

(3)网站代码：搜索引擎爬取的是代码，所以精简的友好于搜索引擎的代码以及代码的独特性（这也是为什么一个模版泛滥之后会有说被降权一说）能够给予网站带来权重影响因素。

(4)网站结构：这里的网站结构只要是指逻辑结构，首先要有一个通顺的层次清晰的链接结构，链接结

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影响智力的因素有哪些

导语：很多朋友都想知道影响智力的因素，那么影响智力的因素有哪

些呢？相信这个问题很多朋友都想知道答案的。接下来，本文就为大家介绍影响智力的

很多朋友都想知道影响智力的因素，那么影响智力的因素有哪些呢？相信这个问题很多朋友都想知道答案的。接下来，本文就为大家介绍影响智力的因素有哪些的相关内容，想要了解影响智力的因素有哪些的朋友可以来看看哦！下面请看详细的介绍。一、遗传因素

即父母的智力水平。遗传对人的智力影响是客观存在的。调查表明，父母智力高的，子女智力往往也比较高；父母智力平常，其子女智力一般；父母智力有缺陷，子女也可能有智力发育不全。遗传对于智力而言，是提供了上下限度，即智力发展的高低的可能性。英国在20世纪70年代的研究表明，先天性遗传疾病造成的智力低下占37％。二、环境和教育因素

是智力发展的外部条件。如出生后个体的成长环境、受教育情况，以及父母的受教育水平、胎教等，环境因素是塑造智力的力量。英国在20世纪70年代的研究结果报告，环境因素造成的智力低下占2 O％，其中特殊疾病和损伤占5％，社会文化原因占15％。我国1984年在北京的调查结果表明，环境因素造成的智力低下占51％。其中特殊疾病和损

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二．

三． 实验名称：细胞的复苏 实验目的：将冻存的细胞恢复活性 实验原理：在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应

极其缓慢，甚至终止。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

四． 实验步骤

一. 实验前准备：

1.将水浴锅预热至37℃，将培养液预热后分装到培养皿中

2.离心管、吸管、培养瓶等等。

二．取出冻存管：

1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三．迅速解冻：

1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min

五.制备细胞悬液：

1.吸弃上清液。

2.向离心管内加入10ml培养液，吹打

影响领导力的因素有哪些

领导力就是指在管辖的范围内充分地利用人力和客观条件在以最小的成本办成所需的事提高整个团体的办事效率。领导力的本质就是影响力，那么影响领导力的因素有哪些?以下是

本人为你精心整理的影响领导力的因素，希望你喜欢。

影响领导力的因素

在现代市场经济的今天，每个企业都追求利益最大化，决定利益最大化的核心之一是领导力。在很多情况下企业过度追求管理方法的改进和完善，却很少重视领导力的问题。举个实践中常见的例子，两个人的管理知识不差上下，甲越干越有劲，工作效率很高，红红火火;乙在管理中导致员工士气低落、积极性不高。其原因就是管理者的能力不同，而这种管理能力就是领导力。

鉴于企业管理者领导力在现代企业管理中对企业实现利益最大化的重要作用与意义，本文对此进行研究，把影响管理者领导力的八个方面的因素加以总结和提炼。

影响领导力的第一因素是优秀的个人品德。古人常说“以德服人”，是指治理国家的过程中，统治阶级要靠良好的德行使百姓归顺。在现代企业管理中，被管理者与管理者具有平等的法律地位，双方之间的关系是平等，双向选择。但由于分工的差异，必然存在管理与被管理，因此管理者必须具有优秀的品德，通过品德对被管理者产生影响，使管理者从思想和行动上积极主动，努力向上