southern杂交原理

分 子 植 物 病 理 学 实 验

--Southern杂交

（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）

核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等 ）

Southern杂交

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检

Southern Blotting技术总结

Southern Blotting溶液的配制： ※、变性缓冲液

1.5M NaCl 0.5M NaOH ※、中和缓冲液

1.5M NaCl 1.0 MTris?HCl Tris,HCl调pH8.0 ※、20×SSC 1L

3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0) ※、2×SSC:

0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0) ※、洗膜液Ⅰ的配制： 2×SSC，0.1%SDS ※、洗膜液Ⅱ的配制： 0.5×SSC，0.1%SDS ※、Washing Buffer:

0.1 M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）,0.3%(V/V) Tween ※、Maleic Acid Buffer：0.1M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5） ※、1×Blocking Solution：10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍（现配现用）；

※、Antibody solution:每次使用前，4℃,10000rpm

Southern杂交

基本概念及原理：Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

Southern印迹杂交

酵母双杂交（筛库）

pGBK-gene 转化酵母

1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测

定OD600，直至OD600达到0.5左右。 4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm

离心5min。

5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 7. 弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮

2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。 9. 加入280μl PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。 10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。

11. 室温下6000-8000rpm离心20

yeast two hybrid 的protocol

介绍

试剂盒物品清单

额外附加物品列表

酵母菌株

酵母载体

方法简述：单杂交文库的构建和筛选

方法简述：双杂交文库的构建和筛选

（七） 构建用于酵母单杂交的报告质粒载体

（八） 构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体

（九） 构建生成cDNA文库

（十） 构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）

（十一） 酵母单杂交文库的构建和筛选

（十二） 酵母双杂交文库的构建和筛选

方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白

方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白

（十三） 分析阳性相互作用结果

（十四） 问题解决指南

（十五） 参考文献

（十六） 相关产品

附录A: 双链 cDNA合成的典型结果

附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法

附录C： 单杂交对照载体信息

附录D： 双杂对照载体信息 目录 （一） （二） （三） （四） （五） （六） 4 7 9 11 14 16 17 18 19 21 27 28 30 30 35 38 44 47 50 51 52 53 54 表格列表

酵母双杂交相关实验方法

一、 酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、 酵母质粒提取试剂

Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、 操作步骤：

(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2) 37℃水浴1h。

(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4) 加入25μl 10% SDS，65℃ 水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9) 加入150μl

原位杂交

1 探针的设计与合成

1) 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号 p81 p82

2) 目的片段克隆

a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：目的PCR片段5 μl

pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积 10 μl

b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。

c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal（20mg/ml），使用无菌的弯头

附件3

人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册技术审查指导原则

本指导原则旨在指导注册申请人对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。

本指导原则是对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

人表皮生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色体17q12，是表皮生长因子

— 1 ——

受体（EGFR）的成员

4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC

配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30° 生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨

注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三

（1） 选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h

7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。

需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。

4月7号星期四

（2） 吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。

下午4点开始 8号 8点结束

Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。

4月8号星期五

（3） 将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（4） 弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒

掉上清液时要小心