流式检测细胞凋亡

9、采用流式细胞仪（FCM）研究MG63细胞周期 FCM检测细胞周期原理

流式细胞仪(flow cytometry或flow cytomyter，FCM)又称荧光活化细胞分拣器(fluorescence activated cell sorter，FACS)是20世纪60年代后期利用激光器和层流流动室而建立的一种用于测定放射性染色体的新技术。细胞周期(cell cycle)是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，包含G1期、S期、G2期、M期四个阶段(图1)。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。用FCM进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件(例如Becton Dickinson公司的Cell FIT)对其进行自动分析。此测定的细胞周期按照DNA的量分可为Go/G1期、S期及G2/M期。

FCM检测细胞周期流程①培养MG63细胞在 6 孔板内依次放

实验14 细胞凋亡的诱导和检测

20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。

细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。

1．

写在课前的话

流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。

一、流式细胞术概念 (一) 概念

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。

(二) 流式细胞术的特点

1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

2.

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细胞凋亡与疾病 death) (Programmed cell death) 主要内容: 主要内容: 1,定义 2,细胞凋亡过程与调控 3,细胞凋亡发生机制 4,细胞凋亡与疾病

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一,定义体内外因素触发细胞内预存的死亡程序引起的细 胞死亡过程. 胞死亡过程. 细胞凋亡的生理意义: 细胞凋亡的生理意义: 确保正常生长,发育: 1,确保正常生长,发育: 胚胎发育过程中, 胚胎发育过程中,指(趾)间组织通过细胞凋亡 形成指(趾)间隙. 形成指( 间隙. 维持内环境稳定: 2,维持内环境稳定: 受损, 突变, 受损 , 突变 , 衰老的细胞以及针对自身抗原的细 癌前病变细胞等大多通过细胞凋亡清除. 胞,癌前病变细胞等大多通过细胞凋亡清除. 防御功能: 3,防御功能: 被病毒感染的细胞通过细胞凋亡,DNA降解 降解, 被病毒感染的细胞通过细胞凋亡,DNA降解,阻止 病毒复制. 病毒复制.

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二,细胞凋亡过程与调控 (一)细胞凋亡过程: 细胞凋亡过程: 凋亡信号转导,凋亡基因的激活, 1,凋亡信号转导,凋亡基因的激活,细胞 凋亡的执行,凋亡细胞的清除: 凋亡的执行,凋亡细胞的清除: 细胞内外因素通过受体,第二信使(cAMP, 细胞内外因素通过受体,第

实验七 流式细胞仪检测技术

免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。

实验原理

流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定

细胞凋亡与疾病

摘要：细胞凋亡是细胞周期的最终生理过程，它对生物的个体发育、存活以及保持正常生理功能都有重要的意义，细胞凋亡规律异常，会给人类造成许多疾病。近几年的研究在凋亡途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展。本文就细胞凋亡与疾病情况进行了综述。

关键词：凋亡 ；调控基因；疾病

随着对细胞凋亡的研究的不断深入，关于病理情况下的细胞凋亡越来越引起人们的关注，迄今已证实细胞凋亡与肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病、神经系统疾病、动脉粥样硬化及艾滋病等的发生、发展密切相关。 1、细胞凋亡的概念

早在1972年Kerr等就描述了形态学不同于坏死性细胞死亡的另一种细胞死亡形式，称之为凋亡性细胞死亡（apoptosis cell death）。近年来才发现细胞凋亡与造血、免疫和肿瘤等有密切关系。从严格意义上讲凋亡与细胞程序性死亡并非完全没等同，细胞程序性死亡意指某些细胞的死亡，是发育中自然出现的生理现象，是指个体发育中的一个预定的并受到严格程序控制的正常变化【1】。而细胞凋亡（apoptosis）指由体内外因素出发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程，是程序性细胞死亡

1) 4) 2 1) 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载）

一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；

加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；

附:细胞固定的一般步骤

取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；

2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；

将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分

钟。在4℃条件下可保存2~3周。

注意：

2 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；

细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，

并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；

2 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；

2 上机检测。 2、新鲜组织的DNA

流式检测细胞周期与凋亡样品处理流程

1.胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液

2.1000r/min离心5min，收集沉淀。

3.沉淀用PBS洗2次，1000r/min离心5min，收集沉淀。

4.细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1ml重悬，4℃过夜。即可送检。

备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集），细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。

2.样品可在-20℃保存一个月

流式检测细胞DNA倍体样品处理流程

1.胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液

2.1000r/min离心5min，收集沉淀。

3. 沉淀用PBS洗2次，加入相应种属的淋巴细胞或鸡红细胞做为内参，内参与

预检测细胞的比例为1：3

4. 1000r/min离心5min，收集沉淀。

5. 细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1ml重悬，4℃过夜。即可送检。

备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集），细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。

2.样品可在-20℃保存一个月

检测胞内蛋白上机前细胞处理流程

1.收集实验处理好的细胞，用PBS洗2次，2%多聚甲醛固定15min。

2.离心弃掉多聚甲醛，再用70%的冰乙醇固定过夜（4℃）。

3.离心弃掉乙

流式检测细胞周期与凋亡样品处理流程

1.胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液

2.1000r/min离心5min，收集沉淀。

3.沉淀用PBS洗2次，1000r/min离心5min，收集沉淀。

4.细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1ml重悬，4℃过夜。即可送检。

备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集），细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。

2.样品可在-20℃保存一个月

流式检测细胞DNA倍体样品处理流程

1.胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液

2.1000r/min离心5min，收集沉淀。

3. 沉淀用PBS洗2次，加入相应种属的淋巴细胞或鸡红细胞做为内参，内参与

预检测细胞的比例为1：3

4. 1000r/min离心5min，收集沉淀。

5. 细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1ml重悬，4℃过夜。即可送检。

备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集），细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。

2.样品可在-20℃保存一个月

检测胞内蛋白上机前细胞处理流程

1.收集实验处理好的细胞，用PBS洗2次，2%多聚甲醛固定15min。

2.离心弃掉多聚甲醛，再用70%的冰乙醇固定过夜（4℃）。

3.离心弃掉乙

流式细胞术讲义

流式细胞术的血液学应用

北京协和医院血液科 汪 玄

流式细胞术讲义

流式细胞术的概念

流式细胞术(Flow cytometry;FCM)是集计算 机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化 学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现 代细胞分析技术，它以流式细胞仪(Flow cytometer)为工具，在单细胞水平上对大量细胞 进行高速(每秒计数可达1000~10000个细胞)、准 确、多参数的定量分析或分选(纯度可达99%以 上),已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分 析技术。

流式细胞术讲义

流式细胞术与PNH的诊断

流式细胞术讲义

原 理

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是 一种获得性基因突变所致的克隆性疾病， 其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂-锚 (GPI-anchor)连接蛋白如CD59,CD55 等表达明显减低或缺乏，导致对补体的敏 感性增强而产生溶血性贫血。

流式细胞术讲义

样本要求： EDTA抗凝血或骨髓3ml 每天上午送检

收费：CD55/CD59

CD59

280元 140元

流式细胞术讲义

临床诊断值 CD59阳性的红细胞大于等于95% CD59阳性的中性粒细胞大于90%

流式细胞术讲义

流式细胞术与 白血病免疫分型