酶常数Km

第二节 酶促反应动力学

一、酶促反应

1913年，Michaelis和Menten根据Henri等提出的酶-底物复合物学说，用简单的快速平衡或准平衡概念推导了单底物的酶促反应方程，即米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation）。酶促反应可表示为：

k1 k2

E + S ES E + P

k-1

酶 底物 酶-底物复合物 酶 产物

根据公式进行推导，反应速率（V0或v）与底物浓度[S]、酶浓度[E]和产物浓度[P]的关系如下：

Vo?[S][P]k2[E][S]Vmax[S] ???dtdtKm?[S]Km?[S]式中Vmax为最大反应速率。这一公式与根据快速平衡学说推导的米-曼氏原始方程形式相同，区别在于用米氏常数Km取代了复合物ES的解离常数Ks，因此仍称

酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算（以日立U3010为例）

强玮 2014-3-31

一、 Km

根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程（Michaelis-Menten equation）：

V =(VmaxS)/(Km + S)

当v=0.5Vmax时，Km=[S]，可见Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般在10-6~10-2mol/L之间，单位一般为mM或者uM。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。

由于Km值与酶的浓度无关，所以计算时无需对蛋白进行定量，理论上诱导破碎的菌体上清（粗酶液）即可用来测酶活计算。具体计算方法以前常用双倒数法，但是这种算法现在稍微好一点的SCI杂志都不认可了，相对来说现在更准确和更常用的计算方法是直接对不同浓度的底物测得的酶活数据用米氏方程（Michaelis-Menten equation V =(VmaxS)/(Km + S)）进行非线性回归（nonlinear regression），拟合的方程中就给出了计算出的Km值。

非线性回归方法相对于双倒数法稍微麻烦的地方在于测量酶活时底物浓度的选择要尽量多，并且要覆盖米氏方程曲线的三个区域，以下图为例，

基于分光光度计法测量计算酶动力参数

酶动力参数Km、Vmax和Kcat值的计算（以日立U3010为例）

强玮 2014-3-31

一、 Km

根据酶促反应方程，即米-曼式氏方程（Michaelis-Menten equation）：

V =(VmaxS)/(Km + S)

当v=0.5Vmax时，Km=[S]，可见Km等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般在10-6~10-2mol/L之间，单位一般为mM或者uM。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。

由于Km值与酶的浓度无关，所以计算时无需对蛋白进行定量，理论上诱导破碎的菌体上清（粗酶液）即可用来测酶活计算。具体计算方法以前常用双倒数法，但是这种算法现在稍微好一点的SCI杂志都不认可了，相对来说现在更准确和更常用的计算方法是直接对不同浓度的底物测得的酶活数据用米氏方程（Michaelis-Menten equation V =(VmaxS)/(Km + S)）进行非线性回归（nonlinear regression），拟合的方程中就给出了计算出的Km值。

非线性回归方法相对于双倒数法稍微麻烦的地方在于测量酶活时底物浓度的选择要尽量多，并且要覆盖米氏方程曲线的三个区域，以下图为

酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 Km 清洗试管24支 清洗试管24支 24

一、概述 酸性磷酸酶： 酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏， 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。

是生物体中重要的一种酶类， 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。 指标。

二、实验原理酶液 磷酸苯二钠 苯酚 + 磷酸氢二钠

folin-酚测定酚的浓度 酚测定酚的浓度计算出反应速度(用产物生成量/min来表示) 计算出反应速度(用产物生成量 来表示) 来表示

根据双倒数法计算出Km及Vmax 及 根据双倒数法计算出

V=

Vmax [S] Km + [S]

三、实验步骤： 实验步骤：

1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 [S]与 4、[S]与V0关系实验 双倒数作图法计算Vmax Vmax和 5、双倒数作图法计算Vmax和Km

blank

buffer substrate enzyme Color developed Certain Time Stop the reaction

生化实验课老

max 是指 最大反应速度。当 底物浓度 足够大时，体系中 酶的活性中心达到饱和状态，其反应速度达到最大。 由此可见，最大反应速度 max 随 酶浓度的变化而变化。 kcat 指反应常数 ( catalytic constant )， kcat 可以由 这个公式计算得到：

kcat = max/[E]

[E] 指 酶浓度，由此可以说， kcat 表示了每单位时间内（秒）每摩尔的酶（或者说每摩尔的活性中心）能够把多少摩尔的底物转化成产物。

Km 俗称 米氏常数，以浓度做单位，米氏常数定义为 反应速度 达到 最大反应速度一半时 的底物浓度。 Km 可以反映出酶与底物的亲和力，Km越低，亲和力越大。

kcat/Km 称为 催化效率，常常以此来比较 不同的酶而同一底物， 或者 不同底物而同一种酶。

KM, kcat, and kcat /KM

KM - The Michaelis constant, KM, is often associated with the affinity of the enzyme for substrate, but this is not always correct. A more accurate statement is t

篇一：过氧化氢酶动力学常数测定

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）

1.7

2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）

(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=

酶活(mgH2O2/g·min)=0.218

（A-B）=0.8 VT=20.25FW=5.032V1=2.5mlt=10min

二、动力学常数的测定 （一）原始数据

（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度

V0

（三）以1/V0对1/[S]0作图（用exc

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2

《国际投资》复习资料

同学们好！

现将本学期期末考试复习资料发给大家，以便使大家尽快进入总复习阶段。本资料所给出的范围占考试内容的70%。对于同学们来说，《国际物流》课程是一门很重要的专业课程，希望同学们通过期末复习对所学习的内容有更进一步的理解和掌握。 第一部分：试题类型说明

一、单项选择题

在下列各题中，请在给定的答案中分别选择一个最适合的答案。（每题2分，共20分）

二、多项选择题

在下列各题中，每题都会有两个或两个以上的答案，请在给定的答案中分别选出所有最适合的答案。（每题3分，共30分）

三、结合实践问答下列问题（每题8分，共24分）

四、计算下列各题（每题8分，共16分，计算过程中小数点后保留2位数字）

五、案例题（10分）

第二部分：复习题目

一、单选题（每题2分）

在下列各题中，在给定的答案中分别选择一个最适合的答案。

1、对（ ）的投资可以形成直接投资。

A、债券； B、股票； C、黄金； D、基金。

2、对（ ）的投资属于间接投资。

A、企业； B、股东； C、债券； D、教育。

3、托宾（James Tobin）的投资选择理论中，“不能将鸡蛋放一篮子里”，主要是指（ ）。

A、提高收益；B、增加收益；C、增加投资产品；D、分散投资风险