植物总rna的提取及电泳检测

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次

总RNA的提

实验九 总RNA的提取、定量与RT-PCR

一、总RNA的提取与定量

目的：

从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5 g RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离

。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用； 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法；

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理； 4、学习并掌握凝胶的制备方法；

5、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法；

6、验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。 【实验原理】

1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞，使之进行扩增和表达的媒介称为载体。在基因工程操作中载体具有以下性质：A.具有自主复制的起点；B.具有多个限制性核酸内切酶的单一识别位点（多克隆位点）；C.具有可供选择的遗传标记；D.具有高拷贝数。

2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外 ,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子 。 除酵母的杀伤质粒为 RNA 外 , 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。 多数质粒只有几千个 bp 但也有一些质粒达105bp 以上 ,一般分子量在 ( 4～100) × 106道尔顿范围内 。不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒（严紧型复制），当质粒

植物DNA、RNA及蛋白 的提取与分析

植物DNA提取

DNA提取原则

保证DNA结构的完整性 排除有机溶剂和金属离子的污染 排除其它核酸分子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 纯化后不应存在对酶抑制性的物质

植物DNA提取的方法

CTAB法 SDS法 煮提法

--植物DNA提取的经典方法

DNA提取的基本步骤

材料的准备(新鲜或冷冻保存) 细胞的裂解(液氮研磨，释放内容物) DNA的分离与纯化(酚氯仿抽提) DNA的沉淀与洗涤(2V无水乙醇或2/3V 异丙醇) DNA的干燥与溶解(ddH2O或TE)

CTAB法流程植物材料 裂解液沉淀

液氮研磨

抽提

离心洗涤

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

CTAB提取液主要成分CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可 溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，通过有机溶剂抽提， 去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即 可使核酸分离出来。

Tris-HCl(pH8.0): 提供一个缓冲环境，防止核酸 被破坏。 EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。 NaCl: 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在 于液相中。

CTAB法步骤1.取约0.1g的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适 量的粉

植物DNA、RNA及蛋白 的提取与分析

植物DNA提取

DNA提取原则

保证DNA结构的完整性 排除有机溶剂和金属离子的污染 排除其它核酸分子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 纯化后不应存在对酶抑制性的物质

植物DNA提取的方法

CTAB法 SDS法 煮提法

--植物DNA提取的经典方法

DNA提取的基本步骤

材料的准备(新鲜或冷冻保存) 细胞的裂解(液氮研磨，释放内容物) DNA的分离与纯化(酚氯仿抽提) DNA的沉淀与洗涤(2V无水乙醇或2/3V 异丙醇) DNA的干燥与溶解(ddH2O或TE)

CTAB法流程植物材料 裂解液沉淀

液氮研磨

抽提

离心洗涤

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

CTAB提取液主要成分CTAB: 十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可 溶解细胞膜，并与核酸形成复合物，通过有机溶剂抽提， 去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即 可使核酸分离出来。

Tris-HCl(pH8.0): 提供一个缓冲环境，防止核酸 被破坏。 EDTA:螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。 NaCl: 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在 于液相中。

CTAB法步骤1.取约0.1g的水稻叶片在液态中磨成粉末，将适 量的粉

南医实验报告

生物化学实验报告

姓 名：

学 号：

专业年级： 级临床八年制

组 别： 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

南医实验报告

【预习报告】 一、 实验原理

1)总RNA的提取与定量

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是

南医实验报告

生物化学实验报告

姓 名：

学 号：

专业年级： 级临床八年制

组 别： 第二实验室

生物化学与分子生物学实验教学中心

南医实验报告

【预习报告】 一、 实验原理

1)总RNA的提取与定量

在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。

RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。

Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是

E.Z.N.A. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps)

步骤

A． 真核细胞和组织

自己需要的材料：

β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC水配置）、除RNase的枪头和EP管。 材料的最佳量

想得到最佳的产量和好的Hibind RNA柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA柱的最大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug的RNA。TRK裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg的组织。 细胞的步骤

1． 用500ul的TRK裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP管或者用

枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。

a) 使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β－巯基乙醇。 b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器

里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加700ul的TRK到T35细颈瓶或10cm的培养皿中，更小的培养器加500ul的TRK。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP管中。 c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpm or

Trizol法提取总RNA

1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol试剂裂解；

②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；

2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；

3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；

4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；

5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清； 6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）； 7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀； 8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录； 9、进行反转录或分装保存于-80℃