滤纸酶活测定方法
“滤纸酶活测定方法”相关的资料有哪些?“滤纸酶活测定方法”相关的范文有哪些?怎么写?下面是小编为您精心整理的“滤纸酶活测定方法”相关范文大全或资料大全,欢迎大家分享。
酶活测定方法
酶活测定方法
还原法
酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。 色原底物法
通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法
该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。 高压液相色谱法
酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。 免疫学方法
常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、
纤维素酶酶活的测定方法
*33*年第"-期中国饲料
—*-—
纤维素酶酶活的测定方法
河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站
刘德海陈小鸽
杨玉华
安明理
饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为!"酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(#$%!&!)起水解作用的酶,称为!’酶。据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于!(酶的!&!法,另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。
"
!&!(羧甲基纤维素)法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研
究所提供。
")")*试剂磷酸氢二钠、
柠檬酸、羧甲基纤维素、+,,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器
-*"型分光光度计、
恒温水浴锅、./0%*酸度计、
秒表。")")1
试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678
磷酸氢二钠液(称取-)
纤维素酶酶活的测定方法
*33*年第"-期中国饲料
—*-—
纤维素酶酶活的测定方法
河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站
刘德海陈小鸽
杨玉华
安明理
饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为!"酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(#$%!&!)起水解作用的酶,称为!’酶。据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于!(酶的!&!法,另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。
"
!&!(羧甲基纤维素)法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研
究所提供。
")")*试剂磷酸氢二钠、
柠檬酸、羧甲基纤维素、+,,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器
-*"型分光光度计、
恒温水浴锅、./0%*酸度计、
秒表。")")1
试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678
磷酸氢二钠液(称取-)
蛋白酶酶活测定方法及原理简介
蛋白酶酶活测定方法及原理 Protease activity assay method and principle
方法
原理
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝
福林酚法
混合物,而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等,可使蛋白质及其水解产物呈上述反应,利用此原理测定蛋白酶酶活。 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合,主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合,使
考马斯亮蓝法
染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色,在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。
甲醛滴定法
蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸,再用甲醛固定氨基酸的氨基,用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸,从而测定其酶活。 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化,得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白(DHT-酪蛋白)。以DHT-酪蛋白为
DHT-酪蛋白法
底物,在蛋白酶作用下,水解生成DHT-肽,二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物,而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白,但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉
纤维素酶酶活的测定方法
*33*年第"-期中国饲料
—*-—
纤维素酶酶活的测定方法
河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站
刘德海陈小鸽
杨玉华
安明理
饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为!"酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(#$%!&!)起水解作用的酶,称为!’酶。据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于!(酶的!&!法,另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。
"
!&!(羧甲基纤维素)法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研
究所提供。
")")*试剂磷酸氢二钠、
柠檬酸、羧甲基纤维素、+,,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器
-*"型分光光度计、
恒温水浴锅、./0%*酸度计、
秒表。")")1
试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678
磷酸氢二钠液(称取-)
总结-酵母酶活测定
2.9.3 β-Galactosidase 酶活定量实验
参考Clontech Yeast Protocols Handbook进行。 酵母酶活测定,
准备:每个样品,8 ml 的YPD培养基,Y190 菌株(转化用)。 Z buffer, Z buffer+beta-巯基乙醇, Z buffer+ONPG, NA2CO3
1) 准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌,同时将ONPG溶解在Z缓冲液中(4 mg/ml,调pH 7.0)并振荡混匀1-2 hr;
2) 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡0.5-1 min,立刻取出2 ml加入8 ml的YPDA中;
3) 30℃ 250 rpm摇3-5 hr,测OD600在0.5-0.8之间并记录确切OD值; 4) 取3个1.5 ml的EP 分别倒入1.5 ml菌液,14,000 rpm离心30 sec,小心弃上清,加入1.5 ml Z缓冲液,振荡以重悬菌体;
5) 离心去上清,加入300 μl Z缓冲液重悬菌体(则浓缩倍数为1.5/0.3=5倍); 6) 取0.1 ml至新管中,液氮冷冻0.5-1 min,37℃ 0.5-1 min使其融化; 7) 反复冻融3次以上使细胞尽可
总结-酵母酶活测定
2.9.3 β-Galactosidase 酶活定量实验
参考Clontech Yeast Protocols Handbook进行。 酵母酶活测定,
准备:每个样品,8 ml 的YPD培养基,Y190 菌株(转化用)。 Z buffer, Z buffer+beta-巯基乙醇, Z buffer+ONPG, NA2CO3
1) 准备5 ml SD/-Leu /-Trp液体培养基过夜培养的酵母菌,同时将ONPG溶解在Z缓冲液中(4 mg/ml,调pH 7.0)并振荡混匀1-2 hr;
2) 旋涡振荡器上将菌液剧烈振荡0.5-1 min,立刻取出2 ml加入8 ml的YPDA中;
3) 30℃ 250 rpm摇3-5 hr,测OD600在0.5-0.8之间并记录确切OD值; 4) 取3个1.5 ml的EP 分别倒入1.5 ml菌液,14,000 rpm离心30 sec,小心弃上清,加入1.5 ml Z缓冲液,振荡以重悬菌体;
5) 离心去上清,加入300 μl Z缓冲液重悬菌体(则浓缩倍数为1.5/0.3=5倍); 6) 取0.1 ml至新管中,液氮冷冻0.5-1 min,37℃ 0.5-1 min使其融化; 7) 反复冻融3次以上使细胞尽可
酶活性测定方法
一、过氧化物酶(POD)活性的测定
POD测定参照李合生等(2003)的愈创木酚法方法进行测定,略加改动。 测定:称取样品0.5g,加入5mL 1/15mol/L PH=7.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成匀浆,4℃条件下12000r/min离心15min,上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml,愈创木酚(0.2%)0.5ml,浓度为0.15%的H2O2 0.5ml,取0.3ml的酶提取液加入到试管中,空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度,加入酶液时开始计时,每隔30s读数一次,连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×VT
POD活性=
0.01×t×Vs×W
式中:△470----反应时间内吸光度值的变化;
VT ----提取酶液的总体积(ml) t----反应的时间(min)
Vs ----测定时取用酶液体积(ml) W----样品鲜重(g)
二、多酚氧化酶(PPO)活性的测定
多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法,略加改动。
酶液制备:称取样品0.5g,加入5mL 0.1mol/L PH=6.0的磷酸缓冲溶液
酶活性测定方法
一、过氧化物酶(POD)活性的测定
POD测定参照李合生等(2003)的愈创木酚法方法进行测定,略加改动。 测定:称取样品0.5g,加入5mL 1/15mol/L PH=7.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成匀浆,4℃条件下12000r/min离心15min,上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml,愈创木酚(0.2%)0.5ml,浓度为0.15%的H2O2 0.5ml,取0.3ml的酶提取液加入到试管中,空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度,加入酶液时开始计时,每隔30s读数一次,连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。
△470 ×VT
POD活性=
0.01×t×Vs×W
式中:△470----反应时间内吸光度值的变化;
VT ----提取酶液的总体积(ml) t----反应的时间(min)
Vs ----测定时取用酶液体积(ml) W----样品鲜重(g)
二、多酚氧化酶(PPO)活性的测定
多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法,略加改动。
酶液制备:称取样品0.5g,加入5mL 0.1mol/L PH=6.0的磷酸缓冲溶液
酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)
1、试剂配制:
(1) pH6.7柠檬酸盐溶液:取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中,另取295g氢氧化
钾溶于水,再将两种溶液合并,用1N氢氧化钠将pH调至6.7,并用水稀释至2L。
(2) 苯酚钠溶液:称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2mL甲醇和18.5mL丙酮,后
用乙醇稀释至100mL(A液),保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中(B液),保存于冰箱中。使用前,取A、B两液各20mL混和,并用蒸馏水稀释至100mL备用。
(3) 次氯酸钠溶液:用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。 (4) 10%尿素溶液:10g尿素溶于100mL水中。
(5) N的标准溶液:精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L,则得1mL含0.1mgN
的标液,再将此液稀释10倍制成氮工作液(0.01mg/mL)。
2、操作步骤
称取5g土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(pH6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24h。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量