酵母表达系统的组成

毕赤酵母表达系统步骤

（参考Invitrogen公司说明书）：

一、 pPICZαA、B、C质粒以及DH5α菌株的保存

1 取0.5μl pPICZα A、B、C质粒，热击转化DH5α，在低盐LB（含有25μg/ml Zeocin）的平板上37℃培养过夜。 2 挑取转化子，甘油保存。 二、 载体构建

1 将目的基因构建到pPICZα载体上，转化DH5α，用Zeocin筛选转化子。

2 提质粒酶切鉴定或PCR鉴定 3 载体测序

测序可用α-Factor引物或5’AOX1引物，3’AOX1引物 三、 线性化DNA

1 提取足够量的质粒DNA（一次转化至少需要5-10μg质粒） 2 酶切线性化10μg构建好的载体，同时酶切空载体做对照，根据载体选择线性化酶切位点（样品分管酶切），pPICZα载体在5’AOX1区域有三个酶切位点可选择：SacI、PmeI、BstXI 3 取1-2μl酶切产物跑电泳，确定是否酶切完全； 4 过柱纯化线性化质粒（用50μl EB洗脱）； 四、线性化DNA的去磷酸化处理 线性化质粒 43μl CIAP Buffer 5μl

CIAP酶 2μl

四、 总体积为50μl的样品37℃ 1h

巴斯德毕赤酵母及启动子

1.1 毕赤酵母表达系统简介

随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。

毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。

翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。

菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,

酿酒酵母表达系统-半乳糖诱导外源蛋白表达实验

培养基：

SC尿嘧啶缺陷培养基（2%GLucose） SC诱导培养基（2%半乳糖）

贮存液：

20%葡萄糖（W/V） 20%半乳糖（W/V） 贮存液过滤除菌，4℃保存。

SC培养基高温高压灭菌，待培养基温度降低至60℃以下后，加入相应体积的葡萄糖或者半乳糖，混匀，4℃保存备用。

实验流程：

1.将转化pYES2的INVSC单克隆接种到15ml SC（2%葡萄糖）选择培养基中。 2. 30℃震荡过夜培养。

3.测定过夜培养菌液的OD600，计算配制50ml OD600=0.4的菌液所需的过夜培养的菌液体积V。

eg：例如过夜培养菌液OD600=3，则V=（0.4OD/ml）（50ml）/（3OD/ml)=6.67ml。 4.取V体积过夜培养的菌液于50ml离心管中，4℃，1500g，离心5min，收集菌体。

5.用1-2ml SC诱导培养基（SC+2%半乳糖）充分重悬菌体，将诱导培养基补充至50ml，，将菌液全部转移至无菌250ml三角瓶中，30℃震荡培养。 6.分别于接种诱导培养基2,4,6,8h后，取5ml菌液测定OD600。 7.4℃，1500g，离心5min，收集菌体。 8.去上清，用

酵母双杂交系统

酵母表达系统的研究进展和前景

( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院 )

摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。

关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物

引言

酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae） 在分子遗传学方面被人们的认识最早， 也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表

很好，需要好好研究一下

原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非 a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案： 1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶； 2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了； 3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。 在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题） 1、制感受态细胞，OD多少比较好？ pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低

2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use

1. 信号肽切割位点和目的基因核苷酸序列5’端的设计酶切位点问题

1.1 目的蛋白N端不要增加氨基酸：a-信号肽在kex2 和ste13处进行切割，

若要目的蛋白不增加额外氨基酸，则需要在kex2对应核苷酸序列前的XhoI作为酶切位点，并补齐信号肽切割所需的序列（酶切位点下游的信号肽对应的核苷酸序列）

1.2 目的蛋白N端可增加氨基酸。则可以选用其他的酶切稳点，保证下游不

出现移码突变就行了。（具体参考具体酶切位点切割点，及其上游核苷酸数有否保证刚好是3的倍数）。

2. 目的基因核苷酸序列3’端的设计酶切位点设计、终止密码子设计 2.1如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；

3. 载体构建问题

3.1 pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选，对于大小

合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的

3.2 pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表。PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp

抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝）， 3.3位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；

3.4虽然α-factor可以

第４０卷第７期

２００９年７月东北农业大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔ４０（７）：５５－５９Ｊｕｌｙ２００９Ａ—ｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

宋庆凤，暴立娟，李杰’

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨１５００３０）

摘要：巴斯德毕赤酵母（Ｐ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达栽体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子一ＧＡＰ启动子替换毕赤酵母表达栽体ｐＰＩＣ９上的甲醇诱导型启动子ＡＯＸ，成功构建了毕赤酵母组成型表达栽体ｐＧＡＰＨａ。并以里氏木霉木聚糖酶基因ｘｙｎ２为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现ｘｙｎ２基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽ＩＮＵ替换栽体上原有的ａ—Ｆａｃｔｏｒ信号肽，结果表明，ＩＮＵ信号肽能够有效引导ＸＹＮＩＩ的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达裁体；ＧＡＰ启动子；ＩＮＵ信号肽

中图分类号：文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９３６９（２００９）０７－００５５－０５

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒

用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白

综述：

基本特征：

作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织

培养等其它真核表达系统更

第九章 人的食物来自环境第一节 人体需要的主要营养物质

食物中的营养成分 常见食物的营养成分编号 食物名称 主要营养成分 生产原料 产地

1 2 3 4

不同的食物中所含的营养成分相同吗？含有同 种营养成分的食物，生产原料都相同吗？

营养的重要性

常见食物的营养成分

常见食物的营养成分

食物中的营养成分

有机物： 无机物：

蛋白质、糖类、脂肪和维生素 水、无机盐

食物中含有蛋白质、糖类和脂肪。不同的食物中含有 的量不一样。

实验

食物中含有蛋白质、淀粉和脂肪

目的：举例说出食物中含有蛋白质、淀粉和脂肪。

器材：面粉、花生种子、烧杯、试管、滴管、碘液、 白纸，角匙、纱布、单面刀片、镊子、清水等。 步骤：1、取1匙面粉，加清水和成面团，用一块叠成双层的纱布包住面团，将用纱布包着的面团放入盛有清水的烧杯中，用手轻 轻地揉挤。观察清水发生的变化。2、将面团放在另一只盛有清水的烧杯中继续揉挤，至不再 有白色物质渗出，取出纱布团并打开，可以看到变成了什么？思 考这是什么物质。 3、渗出的白色物质是什么? 4、脂肪的鉴定：在白纸上挤压花生种子，观察实验现象。

实验分析步骤 1 2 3 4 实验现象 清水逐渐浑浊 纱布里剩下胶状物质 碘液使白色物质变蓝 花生的印迹较透明 实验结论 面团