哪些水产动物用到流式细胞仪检测方法

9、采用流式细胞仪（FCM）研究MG63细胞周期 FCM检测细胞周期原理

流式细胞仪(flow cytometry或flow cytomyter，FCM)又称荧光活化细胞分拣器(fluorescence activated cell sorter，FACS)是20世纪60年代后期利用激光器和层流流动室而建立的一种用于测定放射性染色体的新技术。细胞周期(cell cycle)是指连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程，包含G1期、S期、G2期、M期四个阶段(图1)。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。用FCM进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件(例如Becton Dickinson公司的Cell FIT)对其进行自动分析。此测定的细胞周期按照DNA的量分可为Go/G1期、S期及G2/M期。

FCM检测细胞周期流程①培养MG63细胞在 6 孔板内依次放

流式细胞术

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vanta

蚌埠医学院科研中心

细胞周期/DNA分析（PI法）

一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）

0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：

没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤

1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；

2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；

3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）； 4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次； 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；

6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光

蚌埠医学院科研中心

细胞周期/DNA分析（PI法）

一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）

0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：

没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤

1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；

2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；

3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）； 4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次； 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；

6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光

1) 4) 2 1) 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载）

一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；

加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；

附:细胞固定的一般步骤

取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；

2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；

将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分

钟。在4℃条件下可保存2~3周。

注意：

2 根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；

细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，

并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；

2 加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；

2 上机检测。 2、新鲜组织的DNA

流式细胞术

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vanta

流式细胞仪实验方法

一、 实验准备 1． 标本制备：

2． 最小化非特异性结合：

二、凋亡

1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法

三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA

四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板

五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞

六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病

第一部分 标本处理

一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法

取一定量细胞(约1X10细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法

取一定量

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和

Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACS Vantage 和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能

仪器名称：流式细胞仪

生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法：一．开机程序

1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。

2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。

4．如果需要打印，打开打印机电源。

5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。 7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。

? 做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)

1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2．选取屏幕左列绘图工具中的Do

BD公司流式细胞仪介绍

---FACSCalibur基本型

FACSCalibur分析功能强大，配置灵活，极宽的试剂选择范围、便捷的计算机和软件系统，绝对配合今天高效多能的实验室需要。

FACSCalibur性能卓越，不仅通过其用户友好的整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型，CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，FACSCalibur更以其完美的三色分析功能成为遗传、肿瘤、血液、免疫功能等诸多研究不可或缺的重要工具。

（一）FACSCalibur(基本型)仪器主要特点

? 完美的三色分析系统

可全自动实现CD4T细胞亚群的百分比和绝对计数的检测,满足HIV筛查和治疗监测的全程需要。

? 自动化程度高

FACSCalibur以用户为中心的系统设计，从自动化样本处理、自动上样，到按钮式液流控制、自动化软件获取和分析，每个环节操作都保证简便快捷, 并提供准确客观的实验结果，重复性极好。

? 分析速度快

FACSCalibur荧光检测全部采用大型流式细胞仪国际通用的光电倍增管以保证最快的分析速度10000个细胞/秒。FACSCalibur是目前世界上分析速度最快的台式机之一。

? DNA分析的解决之道

DDM （Dou