CTAB法提取植物DNA

2×CTAB法植物总DNA提取

1. 液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇

研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。

2. 加入500μl的2*CTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。

3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。 若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。

4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。 a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿 b.迅速进入下一步，以免各相混合

5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。 a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。

b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。 6. 在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。

6-1 在抽提出的水

主要试剂的配制

参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：

（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。

（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。

（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。 （4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。 （5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。

（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4

CTAB法提取DNA的原理及步骤：

冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB 。

1.研磨

2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复） 预处理液：Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境，防止核酸被破坏。 EDTA （螯合二价阳离子）0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境，使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成

CTAB法提取DNA的原理及步骤：

冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB 。

1.研磨

2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复） 预处理液：Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境，防止核酸被破坏。 EDTA （螯合二价阳离子）0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境，使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成

CTAB法提取DNA的原理及步骤：

冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA，都要加液氮使材料变脆，易于研磨。低温降低了DNase的活性，利用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来。

CTAB作为一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇，从而去除CTAB 。

1.研磨

2.加1000ul预处理液，10-15min，4000r，10min,弃上清（重复） 预处理液：Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境，防止核酸被破坏。 EDTA （螯合二价阳离子）0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境，使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂，去除酚，糖，能与酚形成

综合性实验设计

——植物DNA的提取及纯度检验方案

班级 组别 成员 指导教师 10级生物科学2班 第七组 刘梦雅、王芳、毛阿威、张杰 刘立亚

2011年11月11日

综合性实验设计

——植物DNA的提取及纯度检验方案

一、 实验目的

1. 学习从生物体中分离核酸的原理和方法； 2. 掌握测定核酸的原理和方法；

3. 掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；

4. 培养学生创新实践能力和团队合作精神，并强化科研反哺教学效果。

二、 实验原理

1、 关于植物DNA制备的基本原理

植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA。细胞质中含有少量的DNA，称之为细胞质DNA，主要分布于线粒体或叶绿体中，分别称为线粒体DNA和叶绿体DNA，细胞内各种DNA称为总DNA。植物DNA的制备，必须首先注意植物细胞的特点：①植物组织中含有坚硬的纤维素，采用温和条件难以破碎细胞；②植物细胞一般具有大的液泡，破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降；③通常植物细胞的DNA含量较低；④植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质，这些杂质往往会与提取的DNA混在一起，给核酸的提取与纯化带来诸多不便。鉴于以上特点，提取植物DNA时除了选

综合性实验设计

——植物DNA的提取及纯度检验方案

班级 组别 成员 指导教师 10级生物科学2班 第七组 刘梦雅、王芳、毛阿威、张杰 刘立亚

2011年11月11日

综合性实验设计

——植物DNA的提取及纯度检验方案

一、 实验目的

1. 学习从生物体中分离核酸的原理和方法； 2. 掌握测定核酸的原理和方法；

3. 掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；

4. 培养学生创新实践能力和团队合作精神，并强化科研反哺教学效果。

二、 实验原理

1、 关于植物DNA制备的基本原理

植物细胞中DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA。细胞质中含有少量的DNA，称之为细胞质DNA，主要分布于线粒体或叶绿体中，分别称为线粒体DNA和叶绿体DNA，细胞内各种DNA称为总DNA。植物DNA的制备，必须首先注意植物细胞的特点：①植物组织中含有坚硬的纤维素，采用温和条件难以破碎细胞；②植物细胞一般具有大的液泡，破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降；③通常植物细胞的DNA含量较低；④植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质，这些杂质往往会与提取的DNA混在一起，给核酸的提取与纯化带来诸多不便。鉴于以上特点，提取植物DNA时除了选

植物DNA的提取分离技术

摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词：植物DNA 提取方法 研究进展

市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12]，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时，也针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。

1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法

在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中

CTAB方法提取RNA

叶片RNA的提取

（1）取叶片材料两克，液氮中研磨成细粉末。

（2）每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500 l β-巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆，65℃水浴温育30min。

（3）每管加入10ml氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴10min。4℃，12000rpm离心10min。

（4）取上清，加入1∕3体积的8M LiCl和500 l β-巯基乙醇，-20℃沉淀过夜。

（5）4℃，12000rpm离心20min。

（6） 弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120 l β-巯基乙醇和880 l 2M Na Ac (pH4.0),混匀后加入5ml的酚：氯仿：异戊醇（25：24：

1）， 涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（7）取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（8）取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），涡旋混匀，冰浴5min。4℃，12000rpm离心10min。

（9）取上清，加入1∕10体积的3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜。

（10）4℃，14000rpm离心

酚氯仿法提取DNA的原理

作者: 渭水凡夫 (站内联系TA) 发布: 2013-04-06

最近在博客上看到的一篇 可以作为入门级 《分子生物学十万个为什么》 和大家分享一下

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？

使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。

缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。 氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？

用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，