PCR引物设计酶切位点

PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表1

PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表2

Pme I

GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG

0 0 0 75 0 10 >90 >90 0 0 10 0 10 0 50 0 10 10

0 25 50 >90 0 10 >90 >90 0 0 25 10 10 0 >90 0 50 75

Pst I

GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT

Pvu I

CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA

Sac I Sac II

CGAGCTCG GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA

Sal I

GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCG G ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCG GAA

Sca I

GAGTACTC AAAAGTACTTTT

10 75 0

PCR引物设计要点

1. 书写规则

设计引物时，5’端引物与目的序列正义链相同，而3’端引物则与目的序列正义链互补，书写时从引物的5’端至3’端（即5’端引物不变，3’端引物与目的序列互补并相反）； 2. 引物长度

一般引物长度为18~30碱基（不包括5’端添加的修饰），引物太长和太短都不好； 3. GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不应超过3个连续的G或C。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大； 4. 退火温度

可以用软件PrimePrimer来计算退火温度，在引物短于20bp时，可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度)，有效引物的Tm为55~65℃之间较好，如果待扩增基因的GC含量较高（超过50%），引物的退火温度可设计得高一点，例如接近65℃，因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。一对引物的退火温度应尽量接近，相差范围应在5℃之内；

一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃，如果扩不出，可试着将退火温度降低5℃ 和升高5℃再试一下，但一般不要1℃ 1℃升，或1℃ 1℃

PCR引物设计过程

（一）设计引物前应的准备工作：

1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用

（二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’ 1．两个酶切位点 2．酶切位点的保护碱基 3．5’端保护碱基 4．3’端保护碱基 5．引物配对区

（三）设计引物所要考虑的问题 1．酶切位点

两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 2．酶的选择

最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。 3．Tm的计算。

Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区

PCR引物设计过程

（一）设计引物前应的准备工作：

1．准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 2．对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 3．准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用

（二）引物的结构：5’—保护碱基+酶切位点+引物配对区—3’ 1．两个酶切位点 2．酶切位点的保护碱基 3．5’端保护碱基 4．3’端保护碱基 5．引物配对区

（三）设计引物所要考虑的问题 1．酶切位点

两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 2．酶的选择

最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer，且较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），这样可以省钱。 3．Tm的计算。

Tm是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区

PCR 引物设计的原则和要点

PCR 引物设计的原则和要点

http://www.77cn.com.cn 2005-5-13 9:13:57 来源：生物中国人

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：

1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60

PCR 之引物设计--------基因序列查询篇 ?确定目标基因的形态：DNA or RNA ?查找目标基因

?比对目标基因同源性和特点 ?选取目标基因序列

?选取目标基因的目标区段

第一步：如何查基因：

1、mRNA 序列的查询； 以查大鼠cort为例；

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

search 选择 nucleotide for 1、rat cort 1、 在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA， Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对

象。

该mRNA文件的命名： Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA； NM_012835：是唯一的编号；

把以下序列存成ｔｘｔ文件：

Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA

* Comment * Features * Sequence

LOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008 DEFINITION

PCR 引物设计的原则和要点

PCR 引物设计的原则和要点

http://www.77cn.com.cn 2005-5-13 9:13:57 来源：生物中国人

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：

1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60

PCR 之引物设计--------基因序列查询篇 ?确定目标基因的形态：DNA or RNA ?查找目标基因

?比对目标基因同源性和特点 ?选取目标基因序列

?选取目标基因的目标区段

第一步：如何查基因：

1、mRNA 序列的查询； 以查大鼠cort为例；

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

search 选择 nucleotide for 1、rat cort 1、 在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA， Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对

象。

该mRNA文件的命名： Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA； NM_012835：是唯一的编号；

把以下序列存成ｔｘｔ文件：

Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA

* Comment * Features * Sequence

LOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008 DEFINITION

基本步骤：

1. 2. 3. 4. 5. 6.

收集拟扩增片段基因的基本信息；

样品扩增目的，与样品性质、数量、样品制作或处理方式，如制作标准曲线； 设计、合成、稀释与保存引物；收集扩增片段长度、扩增温度与时间条件； 普通PCR扩增条件的优化，凝胶电泳证实； 定量PCR条件的设计与标准曲线的制备；

溶解曲线、标准曲线等的判读与应用、标准曲线制备；

7. 改成相对定量测定，相对于内参基因以后的待测基因表达水平变化。

基础 1 X RXN （15 ul体系），除1 ul样标外的溶剂预混 Sense（10uM）: 0.5ul Antisense（10uM）: 0.5ul 2 X PCR mix (东洋纺，含SYBR)7.5ul

H2O (天根): 5.5ul

总体积： 14.0 ul

2 X PCR mix(东洋纺，含SYBR和ROX，产品号：QPK-201)。注释：ROX用于校正加样枪加样体积等（

miRNA常用实验方法；一、miRNA的检测方法；miRNA的realtime-PCR检测方法；1、realtime-PCR引物设计；miRNArealtime-PCR引物设计方法：；1）stem-loopRT引物设计：基于通用的茎；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG；2）realtime上游引物设计：miRNA序列；3）下游引物是通用的，序列miRNA常用实验方法

一、 miRNA的检测方法 miRNA的realtime-PCR检测方法 1、 realtime-PCR引物设计

miRNA realtime-PCR引物设计方法：

1）stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端

6

个碱基即可。通用茎环结构序列为：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT 2）realtime 上游引物设计