Trizol法

总RNA提取（TRIzol法）

仪器和材料：氯仿、异丙醇、无水乙醇、无RNA酶枪头（1000μL，200μL，

10μL）、移液枪、无RNA酶EP管（有1.5mL、2mL、15mL、50mL等不同规格）、75%乙醇（尽量现配现用，配制好后置于4℃冰箱待用）、滤纸、DEPC水、计时器记号笔等

注：上述材料标记好提RNA专用，自己保管好！

操作步骤：

1．细胞悬液按照每5×105~106个细胞加1mL TRIzol，贴壁细胞直接加TRIzol裂解，（1个T25cm2细胞培养瓶可加1~2mL TRIzol，可根据需求来添加），裂解数分钟（5~10分钟，可在倒置显微镜下观察细胞脱落情况），反复用枪吹打或持续振荡以裂解细胞。

2．将上述TRIzol裂解液转移至1.5mL EP管中，每个EP管做好标记，按照每1mL TRIzol加200μL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力振荡（手动）15秒，在室温下放置10~15分钟（观察到明显分层即可）；然后4℃离心机12000rpm离心15分钟。

3．将离心后EP管内上层液体转入新的EP管内（离心后分为3层，注意吸取第一层水相时不要吸到第二层，一般可吸到500μL左右），按照每1mL TRIzol加500μL异丙

Trizol法提取总RNA

1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol试剂裂解；

②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；

2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；

3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；

4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；

5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清； 6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）； 7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀； 8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录； 9、进行反转录或分装保存于-80℃

Trizol法提取RNA步骤

1． 胰酶消化六孔板细胞（每孔相当于3.5cm皿），每孔细胞收于EP管中，PBS洗一遍（或

弃旧培养基，1ml PBSA洗2遍，直接向孔中加入600ul Trizol，吹打细胞，并吸入EP管中即可，无需胰酶消化）；

2． 向细胞沉淀中加入600ul Trizol裂解细胞5min；

3． 加入三氯甲烷（氯仿）120ul（V三氯甲烷：VTrizol=1:5）提取核酸； 4． 振荡10s至粉红色出现时停止，室温静置2~3min后分层； 5． 4℃，12000×g，离心15min，离心后，底部为细胞碎片，中间为DNA，上层为RNA产

物；

6． 吸取上层液相RNA提取液，置另一个EP管中（小心勿吸到沉淀，约为250~300ul）； 7． 每管加入异丙醇300ul（V异丙醇：VTRIZOL=1:2）（异丙醇为有机溶剂，根据相似相溶原理，

RNA不溶于其中，其他杂质溶于其中）； 8． 上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置10分钟； 9． 4℃，12000×g，离心10分钟，弃上清； 10． 用800ul 75%乙醇（用1‰DEPC处理水配制）洗沉淀，振荡器振荡15秒钟； 11． 4℃，12000×g，离心5分钟，弃上清（挥发乙醇2分钟）

TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\\DNA\\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切

TRIzol LS 试剂(ambion)（中文说明书）

货号 规格 室温贮存 10296-010 100ml 10296-028 200ml

产品描述

TRIzol LS试剂适用于液体样品，如人、动植物、酵母、细菌或者病毒来源的液体样品，提取高质量的总RNA（DNA和蛋白质也可以）全过程只需1小时。TRIzol LS试剂里含有酚、异硫氰酸胍和其它成分，由于在摇匀样品过程中能很有效地抑制RNase活性，所以TRIzol LS试剂能维持RNA完整性。TRIzol LS试剂允许同时处理大量的样品。

TRIzol LS试剂能从一个样品里有序分离提取RNA、DNA和蛋白质。TRIzol LS试剂均质化样品后，加入氯仿，能看见分层现象，上层是透明的含RNA的水相，中间层，下层是红色的有机相（含有DNA和蛋白质）。水相RNA用异丙醇能沉淀分离；中间层或者下层中的DNA用乙醇沉淀分离；异丙醇沉淀能使蛋白质从酚-醇相的上清液中沉淀出来。沉淀出的RNA、DNA和蛋白质洗脱杂质，重悬后用于下游。

分离的RNA可以用于RT-PCR, N

层次分析法(AHP)

AHP(Analytic Hierarchy Process)方法，是由20世纪70年代由美国著名运筹学学家T.L.Satty提出的。它是指将决策问题的有关元素分解成目标、准则、方案等层次，在此基础上进行定性分析和定量分析的一种决策方法。这一方法的特点，是在对复杂决策问题的本质、影响因素及其内在关系等进行深入分析之后，构建一个层次结构模型，然后利用较少的定量信息，把决策的思维过程数学化，从而为求解多准则或无结构特性的复杂决策问题提供了一种简便的决策方法。

AHP十分适用于具有定性的，或定性定量兼有的决策分析。这是一种十分有效的系统分析和科学决策方法，现在已广泛地应用在企业信用评级、经济管理规划、能源开发利用与资源分析、城市产业规划、企业管理、人才预测、科研管理、交通运输、水资源分析利用等方面。

一、递阶层次结构的建立

一般来说，可以将层次分为三种类型：

（1）最高层：只包含一个元素，表示决策分析的总目标，因此也称为总目标层。

（2）中间层：包含若干层元素，表示实现总目标所涉及的各子目标，包含各种准则、约束、策略等，因此也称为目标层。 （3）最低层：表示实现各决策目标的可行方案、措施等，也称为方案层。 典型的递阶层次结构如

层次分析法(AHP)

AHP(Analytic Hierarchy Process)方法，是由20世纪70年代由美国著名运筹学学家T.L.Satty提出的。它是指将决策问题的有关元素分解成目标、准则、方案等层次，在此基础上进行定性分析和定量分析的一种决策方法。这一方法的特点，是在对复杂决策问题的本质、影响因素及其内在关系等进行深入分析之后，构建一个层次结构模型，然后利用较少的定量信息，把决策的思维过程数学化，从而为求解多准则或无结构特性的复杂决策问题提供了一种简便的决策方法。

AHP十分适用于具有定性的，或定性定量兼有的决策分析。这是一种十分有效的系统分析和科学决策方法，现在已广泛地应用在企业信用评级、经济管理规划、能源开发利用与资源分析、城市产业规划、企业管理、人才预测、科研管理、交通运输、水资源分析利用等方面。

一、递阶层次结构的建立

一般来说，可以将层次分为三种类型：

（1）最高层：只包含一个元素，表示决策分析的总目标，因此也称为总目标层。

（2）中间层：包含若干层元素，表示实现总目标所涉及的各子目标，包含各种准则、约束、策略等，因此也称为目标层。 （3）最低层：表示实现各决策目标的可行方案、措施等，也称为方案层。 典型的递阶层次结构如

绝对标高点（一般是用混凝土捣成，中间有一段钢筋，钢筋顶标高在当地政府或相关部门有记录其绝对标高是多少）。

高层建筑施工测量

高层建筑物施工测量中的主要问题是控制垂直度，就是将建筑物的基础轴线准确地向高层引测，并保证各层相应轴线位于同一竖直面内，控制竖向偏差，使轴线向上投测的偏差值不超限。

轴线向上投测时，要求竖向误差在本层内不超过5mm，全楼累计误差值不应超过2H/10 000（H为建筑物总高度），且不应大于：30m＜H≤60m时，10mm；60m＜H≤90m时，15mm；90m＜H时，20mm。

高层建筑物轴线的竖向投测，主要有外控法和内控法两种，下面分别介绍这两种方法。 一、外控法

外控法是在建筑物外部，利用经纬仪，根据建筑物轴线控制桩来进行轴线的竖向投测，亦称作“经纬仪引桩投测法”。具体操作方法如下：

1．在建筑物底部投测中心轴线位置

高层建筑的基础工程完工后，将经纬仪安置在轴线控制桩A1、A1′、B1和B1′上，把建筑物主轴线精确地投测到建筑物的底部，并设立标志，如图11-18中的a1、a1′、b1和 b1′，以供下一步施工与向上投测之用。

图11-18 经纬仪投测中心轴线

2．向上投测中心线随着建筑物不断升高，要逐层将轴线向上传递，

绝对标高点（一般是用混凝土捣成，中间有一段钢筋，钢筋顶标高在当地政府或相关部门有记录其绝对标高是多少）。

高层建筑施工测量

高层建筑物施工测量中的主要问题是控制垂直度，就是将建筑物的基础轴线准确地向高层引测，并保证各层相应轴线位于同一竖直面内，控制竖向偏差，使轴线向上投测的偏差值不超限。

轴线向上投测时，要求竖向误差在本层内不超过5mm，全楼累计误差值不应超过2H/10 000（H为建筑物总高度），且不应大于：30m＜H≤60m时，10mm；60m＜H≤90m时，15mm；90m＜H时，20mm。

高层建筑物轴线的竖向投测，主要有外控法和内控法两种，下面分别介绍这两种方法。 一、外控法

外控法是在建筑物外部，利用经纬仪，根据建筑物轴线控制桩来进行轴线的竖向投测，亦称作“经纬仪引桩投测法”。具体操作方法如下：

1．在建筑物底部投测中心轴线位置

高层建筑的基础工程完工后，将经纬仪安置在轴线控制桩A1、A1′、B1和B1′上，把建筑物主轴线精确地投测到建筑物的底部，并设立标志，如图11-18中的a1、a1′、b1和 b1′，以供下一步施工与向上投测之用。

图11-18 经纬仪投测中心轴线

2．向上投测中心线随着建筑物不断升高，要逐层将轴线向上传递，

3、剩余法

用剩余法进行地价评估时，通过对相邻地区商品房销售市场行情相关性分析，预测委估地块预期商品房售价、建筑成本、专业费用以及利息利润等，再运用公式计算地价。

其计算公式为： V=A-B-C

V—待估土地价格 A—开发完成后房地产总价值 B—整个开发项目的开发成本 C—开发商合理利润 详细计算过程如下：

1、确定估价对象最佳开发方式

估价对象按照武汉市商业用地平均容积率设定，确定待估宗地容积率为2.5。

2、确定开发周期和投资进度安排 ①开发周期确定

房地产开发的周期一般分三个阶段，前期主要包括报建、土地的开发（拆迁、场地平整、临时水电等）、勘察、设计、项目招标等；中期主要包括建筑安装工程建设（含设备的安装）；后期主要包括室外附属工程的建设（含室外供水、排水、供电、煤气、绿化、道路、围墙等）。

根据武汉区同类房地产项目的开发周期、估价对象项目的规模及开发项目的实际情况确定开发周期为2年。

②投资进度安排

房地产开发的资金投入根据开发周期的时间也分三个阶段，前期报建、城市基础设施配套费、土地的开发、勘察、设计、项目招标等的费用较少；中期主要包括建筑安装工程建设（含地基、基础的处理、设备及安装等）资金