如何筛选和鉴定营养缺陷型菌株

实验二、芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株的筛选、检出与鉴定

一、实验目的

掌握各种培养基的配制方法；

理解选育营养缺陷突变株的选育原理；

掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法； 获得芽孢杆菌氨基酸营养缺陷型菌株并对其鉴定。 二、实验原理

营养缺陷型是指野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质,才能正常生长的一类突变菌株。其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸、核苷酸、维生素的生产中。也广泛应用于基因定位、杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。

筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、淘汰野生型、营养缺陷型的检出、

[1]

鉴定缺陷型。

1.诱变处理

基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂，对于氨基酸营养缺陷型的诱变常选用亚硝基胍。

亚硝基胍(NTG，N-甲基-N-硝基-亚硝基胍)为诱变剂，在低致死率的情况下又很强的诱变作用，有超诱变剂之称。在碱性时NTG 能形成重氮甲烷(CH

微生物与转基因技术

摘 要 微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因

技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。

关键词 微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体

1 引 言

转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再

八种灵芝菌株的比较及筛选

摘 要：比较了8个灵芝菌株的菌丝生长速度、菌丝体生物量及多糖含量等指标。试验结果表明，在PDA培养基上，沂山灵芝菌株菌丝生长速度最快，为9.91 mm/d；经150 r/min、25 ℃液体摇床培养10 d后，安丘大灵芝菌株获得的菌丝体生物量最高，为1.22 g/100 mL；济宁圆芝菌丝体中的多糖含量最高，为117.59 μg/mg。经过综合分析比较，初步认为沂山灵芝为优势菌株。

关键词：灵芝；菌丝生长速度；菌丝体生物量；多糖含量；优势菌株

灵芝是灵芝属(Ganoderma) 内所有真菌的统称，是一种坚硬、多孢子和微带苦涩的菌类, 生长在腐树或是阔叶树木的根部［1］。世界上已知约有120种，分布广泛，在中国发现的灵芝亚科真菌就达98种［2］。它是我国传统中医药宝库中的珍品，素有“仙草”之称，长期以来一直被视为滋补强壮、扶正固本、延年益寿的珍贵中草药［3］，其中灵芝多糖是灵芝滋补强壮的主要成分，它具有抑制肿瘤、提高机体免疫力、消除体内自由基、抗辐射、降血脂等功效［4~6］。灵芝的药用价值、营养价值及其应用已为世界各国所重视，近年来，灵芝生产发展迅速，但目前栽培的灵芝品种多而复杂，长期以来一直缺乏对不同灵芝菌种

转载自别人的论文,希望对大家的学习作以借鉴

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(12):5362-5363,5371　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　张杨林　责任校对　

傅真治

高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选

唐丽江,王振华,王迪　(成都农业科技职业学院畜牧兽医分院,四川温江611130)

摘要　[目的]筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[方法]选用10株芽孢杆菌,采用染色法初选和3,5-二硝基水杨酸显色法复选对其产淀粉酶的能力进行测定,筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[结果]10株芽孢杆菌菌株中有9株具有产淀粉酶能力,其中编号为Pab03、Pab02的2株枯草芽孢杆菌产酶活性最高,染色圈直径/菌落直径分别为2.284、1.961;在未作发酵条件优化的前提下,其酶活力分别达到(31.331±(21.521±0.985)、1.390)U,在作为新型的消化酶饲料添加剂方面具有广阔的应用前景。而菌株凝结芽孢杆菌PSAF1和枯草芽

(0.704±孢杆菌PJK01所产淀粉酶活力最低,分别为(0.366±0.022)、0.089)U。[结论]成功筛选了2株高产淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株,

分别

实验六十 淀粉酶产生菌株的筛选

实验项目性质：设计性

所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时

一、实验目的

1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。

二、实验原理

α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。

1、采样：即采集含菌的样品

采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。

2、增殖培养（又称丰富培养）

增殖培养就是在所采集的土壤

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的

粮油食品科技第21卷2013年第4期

生物工程

99

多杀菌素高产菌株快速筛选

方法的研究

陈

园1，2，熊

犍1

，王

超2，Eddie Chio 2，邹球龙2，张晓琳

2

(1．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510641;2．国家粮食局科学研究院，北京100037)摘

要：研究利用多杀菌素对蚊子幼虫致死率与其浓度的相关性，以蚊子幼虫为靶标动物建立基于

活体筛选的多杀菌素高产菌株高通量快速筛选模型。通过比较蚊子幼虫的致死率筛选获得多杀菌素产量较高的菌株。结果显示:2龄埃及伊蚊幼虫具有高的敏感性和精确性，生测曲线拟合获得的毒力回归方程标准误差(SE )较小，最适宜作为供试虫源用于快速初筛模型。方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。

关键词：刺糖多孢菌;多杀菌素;通量;生物检测中图分类号：TS 201．3

文献标识码：A

文章编号：1007－7561（2013）04－0099－04

Rapid screening method of high yield strains spinosad

CHEN Yuan 1，2

，XIONG Jian 1，WANG Chao 2，Eddie Chio 3，ZOU Qiu －long 2，ZHANG Xiao －lin 2

（1．Coll

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类

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土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选

一、 实验目的

1、 掌握从土壤中分离产淀粉酶菌株的方法 2、 掌握平板法分离与纯化微生物的技术 3、 进一步熟练和掌握无菌操作技术 二、实验原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。

分离得到的单个菌落还要进行性能的筛选,分为初选和复选. 三、实验材料

样品:张

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选

一 实验目的

1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。 2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。 3．掌握分离纯化微生物的方法。

4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。 二 实验原理

在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的