pcr芯片技术
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MEMS生物芯片--PCR芯片技术
个人收集整理 仅供参考学习
MEMS生物芯片技术
——PCR芯片技术
勾海波 22011325
近年来, 科学家们在微机电系统(MEMS) 、纳米技术和分子生物学领域取得了无可争议的进步和突破, 将这些技术结合起来形成功能更强大的分析系统成为目前人们科学探索的目标。生物MEMS(BIOMEMS) 将MEMS 技术应用在生物、医学领域,研究适合于生物领域的微器件和微制造系统, 是最具吸引力的。特别是在寻找新基因、DNA 测序、疾病诊断、药物筛选等方面, 是最有应用前途的研究方向。
BIOMEMS 的研究内容主要包括在生物体外进行生物医学诊断的微系统和在生物体内进行生物医学治疗的微系统。微机械制造技术使BIOMEMS 具有微米量级的特征尺寸, 得以实现器件和系统的微型化, 使生物医学的诊断和治疗可以快速、自动化、高通量、较小损伤地完成。BIOMEMS 技术批量生产能力更极大地降低了生物医学诊断和治疗的成本, 因此BIOMEMS 技术已成为21 世纪科学研究和商品化的主要研究目标。
生物微机电系统( BIOMEMS) 是在生物医学工程中使用的MEMS, 其中最典型的就是生物芯片。由尺度效应可以知道,MEMS
PCR技术及其应用
第八章 PCR技术及其应用
PCR技术的建立① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
②
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
③
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)100
酶 80 活 性 6040
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
Kary B. Mullis <
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
实时荧光定量PCR技术
天为时代核酸系列讲座之院
华中科技大学同济医学
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20
讲 座 提 纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？
定量原理
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：横坐标：扩增循环数(Cycle);纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
实时荧光定量
实时荧光定量PCR技术
天为时代核酸系列讲座之院
华中科技大学同济医学
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20
讲 座 提 纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术：
实时原理
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？
定量原理
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析
介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线
荧光基团
荧光检测元件
扩增曲线图：横坐标：扩增循环数(Cycle);纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
实时荧光定量
实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术
1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA
PCR技术及注意事项
PCR技术应用及注意事项威斯腾生物技术中心 TEL:400 675 6758 2014.9.1
背景
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是一种用于放大扩增特定的 DNA片段的分子生物学技术。
1971 Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想； 1983年Mullis发明并申请专利。
原理
根据DNA的半保留复制。相关酶
双链DNA
单链
DNA聚合酶 碱基互补配对
复制
两分子拷贝。
在体外实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复 性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物， DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
反应体系
缓冲液 4种dNTP混合物(终浓度) 引物(终浓度) 模板DNA Taq DNA聚合酶(耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个 循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。)
Mg2+(终浓度) 双蒸水
步骤
变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR
核酸分子杂交及PCR技术
核酸的分子杂交技术
一、核酸分子杂交
用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类
液相杂交
核算分子杂交 印记杂交
固相杂交
原位杂交
1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭
缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性：
在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 ﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变
PCR技术培训教材
PCR 培训教材
PCR基础理论
一、半保留复制及转录、逆转录
(1)DNA的半保留复制(semiconservative replication)
DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制(replication)由亲代传给子代。在DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(图1)。
(2)RNA的转录（transcription）过程
以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息由DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNA