Gateway技术构建载体

一、目的基因的a(4.2k) PCR

1、PCR体系（引物ath-a-4.2k-F ath-a-4.2k-R 酶 fusion聚合酶 体积单位 μ l） DNA fusion 5*fusionHF 2.5mM F R ddH2O Buffer dNTP 2 *3 0.25 0.75 4 12 2 6 0.5 1.5 0.5 1.5 10.75 32.75 totle 20 60 98°C 30s 98°C 15s 56°C 30s 72°C 4min30s 72°C10min 16°C∝ 30cycle

（注：聚合酶说明：fusion聚合酶是高保真聚合酶，扩增片段为平末端） 2、跑胶

1％琼脂糖凝胶胶跑20min，观察实验结果。 3、胶回收（试剂盒回收） （1）、在紫外光下将扩增条带用刀切下，要尽量快（紫外会诱导基因突变）放在1.5mL的离心管中；（注意：刀头尽量伸进离心管内部，防止污染离心管外部可接触部位） （2）、在离心管中加入300-400μ l的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C水浴锅加热溶解直至透明； （3）、加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。 （4）、吸取步骤3

河南农业大学牧医工程学院

Gateway 基因克隆

Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。

这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。

一、Gateway 基因克隆的原理及机制

Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地

关于表达载体的构建

1. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类

载体既有复制子，更要有强启动子； 2. 大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子

（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。

（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。

我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。

3. 载体构建的步骤 （1）.设计引物

1.引物的长度 用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则

河南农业大学牧医工程学院

Gateway 基因克隆

Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。

这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。

一、Gateway 基因克隆的原理及机制

Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

载体构建 目的基因克隆引物设计PCR质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培养基中过夜培养挑菌并菌液PCR上述菌液PCR有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则该载体构建成功。 一、原理 依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。 二、操作步骤 1、摇菌（制作感受态细胞备用）

取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）

依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）

反应所需试剂 体积（单位：ul） 质粒 10 所需内切酶反应缓冲液

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

（4） P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

1 / 1文档可自由编辑

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位

以导学案为载体，构建任务型课堂

作者：顾飞英

来源：《现代语文(教学研究)》2013年第12期

语文学习是一个长期的、潜移默化的过程，学生在课堂上学到的方法、知识，获得的感悟、体验，需要经过一段时间才能逐渐内化为个人的知识结构，并使自己的语文应用能力最终得以顺利地生成和发展。教学过程中如何充分发挥学生的主体作用，如何更加科学地实施教学，使教学更加有效，一直是我们关注的问题。但是由于我们对新课程理念理解、领会的偏差，以及实践经验的缺乏，前阶段在课堂教学改革中出现了许多非语文、泛语文、形式化、低效化的现象。那么，如何提高课堂有效性？不同的学者从不同的教学理念出发，提出了多种方法，本文结合初中语文课堂教学的实例谈一些看法。

一、任务型课堂——推进新课程改革的需要

新一轮基础教育课改的重点是全面推进素质教育，发展学生的创新能力，大力提倡探究学习、自主学习和合作学习的教学组织策略。任务型课堂的实施建立在学生能使用这些课堂学习策略的基础之上，同时也能促进学生对这些策略更好地使用。

我们先来看一段年轻教师上的公开课，《济南的冬天》的课堂实录片段：

……

师：那谁说说济南冬天最大的特点？

生：温晴（其他同学也表示同意）。

师：能说一下你的理由吗？

生：在这里，作者通过和北平、伦敦

第４０卷第７期

２００９年７月东北农业大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔ４０（７）：５５－５９Ｊｕｌｙ２００９Ａ—ｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

宋庆凤，暴立娟，李杰’

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨１５００３０）

摘要：巴斯德毕赤酵母（Ｐ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒ／ｓ）是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达栽体种类繁多，却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子一ＧＡＰ启动子替换毕赤酵母表达栽体ｐＰＩＣ９上的甲醇诱导型启动子ＡＯＸ，成功构建了毕赤酵母组成型表达栽体ｐＧＡＰＨａ。并以里氏木霉木聚糖酶基因ｘｙｎ２为报告基因进行功能验证，结果表明，该载体可实现ｘｙｎ２基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽ＩＮＵ替换栽体上原有的ａ—Ｆａｃｔｏｒ信号肽，结果表明，ＩＮＵ信号肽能够有效引导ＸＹＮＩＩ的分泌。

关键词：毕赤酵母；表达裁体；ＧＡＰ启动子；ＩＮＵ信号肽

中图分类号：文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９３６９（２００９）０７－００５５－０５

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ

近年来,复合载体夯扩桩技术在基础工程中均得到了广泛的应用,通过对载体桩和锤击沉管混凝土夯扩桩两者受力原理、设计及施工方面的对比分析,了解两者的区别和联系,为复合载体夯扩桩和锤击沉管混凝土夯扩桩的推广应用提供参考。

圆圆

工程技术

复合载体夯扩桩技术初探①桑绍彬

c江苏中盛建设集团有限公司江苏徐州 2 1 0 ) 2 0 0摘要：年来，近复合栽体夯扩挂技术在基础工程中均得到了广泛的应用，通过对裁体桩和锤击沉管混凝土夯扩桩两者受力原理，设计及施工方面的对比分析，了解两者的区别和联乐。为复合裁体夯扩桩和锤击沉管混凝土夯扩桩的推广应用提供参考。 关键词：裁体桩夯扩挂对比分析中图分类号： U 5 . T 7 33文献标识码 t A文章编号： 2 3 9(0 11 () 0 3—0 1 7- 7 12 1 )2a一 0 4 2 6Ab ta t I r cn y a s c mp st c rir a src:n ee t e r,o o ie a re r mme pl fun ain n ie r n t c n lg e a e d ie o d to e g n e ig e h oo is r wi ey p le t e ie n ha d l a