重组质粒dna的转化及筛选实验报告

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类

重组质粒的转化

重组质粒的转化(热休克法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:

1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。

4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DN

质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；

3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理

1.PCR(多聚酶链式反应)

在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。

PCR一次循环的具体反应步骤为：

A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。

C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒DNA的提取与制备 (1).碱裂解法：

染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异： A.高碱性条件下，染色体DN

实验一 质粒DNA的微量制备（4学时）

实验目的

(1) 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 (2) 掌握碱裂解法分离、纯化质粒DNA的方法。

实验原理

质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。目前，质粒已广泛的用作基因工程中目的基因地运载工具—载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA，是一种分子生物学最基本的方法。

质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤都大同小异。本实验着重介绍碱裂解法制备微量DNA。

在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

一、实验目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料

大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）

四、实验仪器、用具

高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪

五、实验试剂

LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液：

实验一 质粒DNA的小量制备

（碱裂解法）

一、

实验原理

所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：

①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。

本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。

环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），

实验一 质粒DNA的小量制备

（碱裂解法）

一、

实验原理

所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：

①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。

本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。

环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），