基因敲除小鼠尾dna提取方法

DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书 作者: Allanflying (站内联系TA) 发布: 2012-09-11

一．利用DNeasy? Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA 1．前处理： 注意：

1） 石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp，还要视样本类型与保存年限而定。 2） 固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。 3） 溶解时间随样本类型和溶解状态而定。 4） 产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。 5） 开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤9）。 1.石蜡包埋组织的前处理 操作步骤：

1） 将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入2ml离心管中（自备）。 2） 加入1200ul的二甲苯，用力涡旋震荡。 3） 最大转速室温（15-25°）离心5分钟。 4） 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。

5） 往沉淀中加1200ul的

各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法

一，基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管

植物DNA的提取分离技术

摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词：植物DNA 提取方法 研究进展

市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12]，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时，也针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。

1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法

在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中

7.19

同源臂通常是指打靶载体上待插入的外源序列两侧的与基因组序列完全一致的侧翼序列，用于识别并发生重组的区域

同源序列是指在同一物种不同个体间或不同物种间相同或相似的DNA序列，而同源臂是指一段同源序列，类似于tRNA氨基酸臂的结构，所谓臂，指的是手臂样结构。

T载体的定义：

T载体（T-Vector）是一种高效克隆 PCR 产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。

T载体的作用原理：

大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提高了PCR产物连接和克隆的效率。

T载体进行TA克隆的优势：

相对于另一种非定向克隆——平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、高效、一步到位的非定向克隆法。有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率高。

T载体的制备：

?

商业化T载体：

一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆

DNA提取

191

论　著 　

线粒体DNA提取方法的比较3

李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣

第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)

　　摘要　目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。

关键词　线粒体;DNA;分子遗传学

　　1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1　材料和方法111112　细

DNA提取

191

论　著 　

线粒体DNA提取方法的比较3

李伟文　陆松敏　刘建仓　武　凡　李　萍　柏干荣

第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)

　　摘要　目的将提取线粒体DNA的碱变性法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线Triton法、粒体DNA的方法。方法分离Wistar大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体ATPase8亚基基因PCR扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA量最多,Triton法最少。OD260 ～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA用于OD280均在1.78结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA具有操作简单,PCR扩增,测定出了线粒体DNAATPase8亚基基因序列。产量多的优点,该法所提取mtDNA可用于mtDNA测序。

关键词　线粒体;DNA;分子遗传学

　　1981年,Anderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA(mtDNA),进行了全序列分析。此后,mtDNA的研究日益得到重视。本实验将Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1　材料和方法111112　细

实验二 植物基因组DNA的提取

Tris 读音 “吹斯” 脱氧核糖核酸酶DNase

是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。 淀下来，而DNA溶解在溶液中。

锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平

苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂， 造成DNA降解。苯酚使蛋白变性，离心时沉

在提取DNA时用的原料成分的关系,很多植物源提取材料里面含有酚类物质,酚类物质是芳族环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物

酚类物质如果经氧化后就会很容易于DNA共价结合引起褐变.这就是褐变现象,为有效除去酚类物质，需要在研磨时加入抗氧化的PVP，用PVP是利用

它的“CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强，结合成复合物后,通过离心除去。另外，在化合物被氧化。

加入提取液时，加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活，防止酚类物质

主要试剂的配制

参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：

（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。

（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。

（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。 （4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。 （5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。

（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4

２００８年７月第１８卷第７期

中国比较医学杂志

ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬ

ＯＦ

Ｊｕｌｙ，２００８Ｖ０１．１８

Ｎｏ．７

ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥＭＥＤＩＣＩＮＥ

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高脂饮食ＡｐｏＥ基因敲除小鼠不同部位动脉

粥样硬化斑块的分析比较

晏沐阳１，翟永志１，刘

（１．解放军总医院老年心血管研究所，北京

博２，张云凤２，彭勃１

１００８５３；２．北京大学医学部，北京

１０００８３）

【摘要】目的

比较高脂喂养的ａｐｏＥ基因敲除小鼠主动脉窦部和头臂动脉粥样硬化斑块的病理组织学状

况。方法选取６周龄雄性纯合子ａｎｐＥ基因敲除小鼠３０只，均予以西方饮食喂养，分别在３０周龄、４２周龄、５４周龄、６６周龄、７８周龄时，随机各取６只，取主动脉窦和头臂动脉做病理检测。酶法检测血脂情况，冰冻切片光镜下观察主动脉窦部和无名动脉粥样硬化斑块病理情况，ｖｏｎｋｏｓｓａ染色观察斑块钙化情况。结果

高脂喂养可使ａｐｏＥ基

因敲除小鼠迅速形成广泛且典型的动脉粥样硬化斑块，随时间进展，斑块体积逐渐增加，钙化逐渐加重；头臂动脉斑块出现较主动脉窦早且更加明显，斑块内包埋纤维帽，在主动脉窦斑块未见，但斑块钙化以主动脉窦部斑块最显著。结论高脂喂养ａｐｅＥ基因敲除

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离