Western印迹

3 Western blot

3.1 试剂配制

1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：

丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。 2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：

SDS，10g；H2O，80mL。68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。

3）10%过硫酸铵（AP）：

AP，1g；H2O，10mL。避光，4℃保存。（4℃2周） 4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：

Tris，18.17g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。 5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：

Tris，12.11g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。 6）电泳缓冲液（10×）：

甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。 7）5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：

1MT

1.4.9 细胞裂解液

50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS

1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）

称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。 1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液

去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。

1.4.12转膜缓冲液

Tris碱 3.03g，甘氨酸 14.4g，甲醇 200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。4℃避光保存。 1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)

Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。 1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）

Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。 1.4.15 10%SDS

SDS 10g，ddH2O定容100ml。 1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤

一、 组织的研磨

准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套 步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、 裂解提蛋白

准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1

若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）

步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40

Western印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3水平文库

Western印迹方法测定血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3水平

2011-05-09 吴咏梅 邓洁英 史轶蘩

【摘要】 目的 研究正常人及生长激素分泌异常病人血清中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的水平。方法 本文采用Western印迹方法测定20例正常人，33例活动性肢端肥大症病人和34例特发性生长激素缺乏症(IGHD)病人血清IGFBP-3水平。结果 正常成人血清中存在五种分子量不同的IGFBP，IGFBP-3含量为最高。本文测定了20例正常成人和67例生长激素分泌异常患者血清IGFBP-3的相对光密度(ROD)，正常人血清IGFBP-3含量为(1.1±0.4)ROD，活动性肢端肥大病人为(2.7±1.2)ROD，明显高于正常成人(P＜0.01)，IGHD病人为(0.4±0.2)ROD，明显低于正常成人(P＜0.01)。血清生长激素与IGFBP-3、胰岛素样生长因子-I与IGFBP-3均呈正相关(P＜0.05)。结论 Western印迹测定血清IGFBP-3正常值和病理值提示IGFBP-3浓度的变化与生长激素功能状态密切相关，并

Western blot

所涉及的Western blot实验在蛋白上样缓冲液中均加有巯基乙醇，上样之前加入终浓度为50 mM的DTT在60oC处理10分钟。

本论文所涉及的Western blot实验所用的SDS-PAGE蛋白胶的浓度均为8%。

拟南芥总蛋白提取：

(1) 在1.5 ml EP管中用液氮研磨200 mg植物材料； (2) 加入200 μl提取液后继续研磨直到植物材料重复磨碎；

(3) 4 oC高速（13000rpm）离心15分钟，取上清移入一个新的EP管； (4) 4 oC高速重复离心15分钟，取上清移入一个新的EP管； (5) 提取好的蛋白溶液可分装到多个EP管，冻于-80 oC备用。 蛋白质浓度的测定（Bradford法）：

材料和方法

(1) 分别在两组1.5 ml离心管中各加入0.5 mg/ml BSA（5，10，15和20 μl）， 以0.15 mmol/L NaCl补足至100 μl，同时以两管100 μl的0.15 mmol/L NaCl做空白对照；

(2) 每管各加入1 ml考马斯亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟； (3) 以波长595 nm测量OD值，取A线，并测量待测样品

Western blot

一、Western blot历史及原理

蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，简称WB。1975年，继Edwin Southern发明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事发明的“Northern Blot”技术之后，受以上两个“转印”技术的启示，1981年“Western Blot”这一技术正式问世。抗体技术的发展，电泳及转膜技术的改进使得Western Blot操作日益简单；分析方法及工具多样化、成像技术的革新、高灵敏度示标信号的出现使得Western Blot的检测范围得到扩展，定量/半定量成为可能。目前Western Blot设备不断更新、技术不断发展，WB仍将在较长时间和应用领域内得到更加广泛的应用，其检测灵敏度也将不断提高。

其基本原理与ELISA相似：通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离混合蛋白质样品，转印到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以转印到固相载体上的蛋白质（多肽）作为抗原，与对应的抗体（又称一抗）特异性结合，特异性抗体再与酶、荧光素或同位素标记的抗一抗抗体（

8.1.3 细胞收集与裂解

（1）细胞收集：常规胰蛋白酶消化、离心收集细胞于1.5mL eppendorf无菌管，并做好标记。（2）细胞洗涤：4℃，2500rpm离心5分钟，用4℃预冷的1×PBS洗涤两次。（3）细胞裂解：用100μL事先配好的含有1mM PMSF的RIPA裂解液吹打悬浮细胞，放入-20℃冰箱15分钟，再次吹打悬浮，放入-20度冰箱15分钟。（4）蛋白离心：如此重复两次后，4℃，12000rpm离心10min，取上清（蛋白质）。（5）蛋白总浓度测定：取5μL（或2-5μL）上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白总浓度，实验根据说明书实验步骤操作，测出蛋白-吸光度标准曲线及各组蛋白总浓度。（6）蛋白变性：剩余蛋白样部分以4:1的体积比与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴5min。（7）蛋白浓度均一化：待样品自然冷却后，根据蛋白浓度测定结果，用RIPA稀释好的1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液将各组蛋白调至相同浓度，放入-20度冰箱保存备用。

8.2 SDS-PAGE胶配制

（1）10% SDS-PAGE下层胶配制：按照说明书，依次加入相应体积的超纯水、30?r-Bis、下层胶缓冲液（4×）、10%A

蛋白质免疫印迹技术及

常见问题分析张绍进

Western Blot

Western Blot简介

Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析

Western Blot

Western Blot 简介：

印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利 用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方 法，称为Southern印迹法。

而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后 蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

Western Blot

Western Blot 基本原理

Western Blot

Western Blot 优点

高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应

1-5ng中等大小的靶蛋白

Western Blot

Western Blot应用

目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析

Western

蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析

Western Blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。

Western Blot应用：目的蛋白的表达特性分析，目的蛋白与其它蛋白的互作，目的蛋白的组织定位，目的蛋白的表达量分析。

Western Blot 流程：蛋白样品的制备，制胶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗杂交，二抗杂交，底物显色。 （一）蛋白样品的制备：

提取总蛋白:所有操作在冰上进行,且所有操作要对着容器壁操作，防治将细胞吹落；操作前先用PBS将细胞洗2变。

1.将原瓶/皿中放入5ml生理盐水或PBS，根据细胞团块大小加入100-300μl RIPA裂解液，吹匀后，4℃摇床30min。

2. 4℃，12000×g 15min，离心后取上清，测浓度。

BCA蛋白浓度测定方法： 原理

碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在570nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 特点

1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1-20微升。

2. 在50-2000微

人的一生，就像一条漫长的道路，而一次次的成长，就是这条路上的一朵朵鲜花。现在，让我们欣赏一下我成长道路上开得最艳的那朵花儿吧。

记得那是一个风和日丽的下午，我的肚子咕咕直叫，好饿啊～我要饿死了”没办法，人是铁，饭是钢啊。我赶紧起身，马上奔到客厅，费尽口舌地央求爸爸，可是爸爸眼珠一转，对我说：你是个大孩子了，应该自己想办法解决问题了哦。”

那么我该做什么呢？”先从最简单的开始学好了，有了，你就做荷包蛋吧”。可是”我小声地嘀咕着，心里也打起了退堂鼓。正当我想退缩的时候，咕咕咕的声音又响起来了：求你了老兄，你可以的，大胆的尝试吧！”唉～没办法了，我只好去冒险”一把了。

人人都说万事开头难”，对我来说也是如此。我按爸爸教给我的操作流程，作文先小心翼翼的把油倒进锅里，开了火，等油热了以后，轻轻地敲开蛋壳，把蛋液倒进锅里，之后，我迅速缩回了手，生怕油溅到我身上。正当我以为一切都妥当了的时候，锅里冒出了一股烟，我急忙凑过去看。坏了，原来我忘了将荷包蛋翻面了。我急忙将荷包蛋铲出锅，天啊！一面是白白的孩儿脸”，而另一面是煎的不能再糊的老人脸”。我又