蛋白质沉淀反应实验注意事项

蛋白质的沉淀反应

一、目的和要求

1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、掌握几种沉淀蛋白质的方法 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、沉淀反应 （一）原理

在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：

1、可逆沉淀反应

沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显著变化。在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。

2、不可逆沉淀反应

蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

（二）盐析 1、材料与试剂

（1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白前期准备

（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。

（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。 （3）透析Buffer的选择可参考文献。

蛋白复性

包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。

包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。

如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。这里主要考虑第二种方案。

包涵体的洗涤

破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM

Ⅱ实验内容

实验一 蛋白质的沉淀与凝固

蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。

促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：

第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。

第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。

一、 蛋白质的盐析

[原理]

高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。

由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。

实验7 蛋白质的等 电点测定和沉淀反 应

I. 蛋白质等电点测定 一、目的： 目的： 了解蛋白质的两性解离性质 学习测定蛋白质等电点的一种方法

二、原理： 原理：蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡： 蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：+ OH+ H+ NH3+ COO+ OH+ H+ NH2 COO-

Pr

NH3

+

Pr

Pr

COOH

pH< pI净电荷为正

pH = pI净电荷=0 净电荷

pH > pI净电荷为负

蛋白质等电点：当蛋白质颗粒上正负电荷 蛋白质等电点： 数目相等时溶液的pH值 数目相等时溶液的 值。 处于等电点时的蛋白质在电场中不发生移 动；处于等电点时的蛋白质溶解度最低。 处于等电点时的蛋白质溶解度最低。 用醋酸与醋酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶 用醋酸与醋酸钠( 液中)配制成各种不同 值的缓冲液 值的缓冲液。 液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向缓 冲液溶液中加入酪蛋白后， 冲液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓 冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 冲液的 值即为酪蛋白的等电点。 值即为酪蛋白的等电点

三、器材1.水浴锅 2.温度计 3.200毫升锥型瓶 4.100毫升容量瓶 4.100 5.吸管 6.试管 7.试管

蛋白质纯化方法

蛋白质浓缩有多种方法，有盐析，超滤，离子交换，有机溶剂沉淀等方法。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。医学教育`网搜集整理有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤）

TCA-DOC

For precipitation of very low protein concentration

1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent).

2) Vortex and let sit for 30min at 4oC.

3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC

(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves!!!).

4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube

沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤）

TCA-DOC

For precipitation of very low protein concentration

1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxycholate, detergent).

2) Vortex and let sit for 30min at 4oC.

3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC

(preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottleat 4oC.Be careful, use gloves!!!).

4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① FRET技术（in vivo）

FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

②酵母双、三杂交技术（in vivo）

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两

第五章 蛋白质（Protein) 本章主要内容（Content）

蛋白质的一般性质（General aspects)

■ 结构 ■ 蛋白质-水相互作用，影响蛋白质水溶性的因素 ■ 蛋白质-脂的相互作用 蛋白质的变性（Denaturation）

■ 蛋白质变性产生的效应 ■ 导致蛋白质变性的物理因素 ■ 导致蛋白质变性的化学因素

蛋白质的功能性质（Functional Properties） 定义与分类

水化性质 溶解度与粘度、凝胶作用

组织化 热凝结和形成、纤维的形成热塑挤压、面团 乳化性质 乳化能力与乳化稳定性 起泡作用 起泡性与泡沫稳定性 ?蛋白质的营养特性（Nutritional properties） ?蛋白质的开发利用（Utilization）

植物蛋白质和动物蛋白质：浓缩蛋白质与分离蛋白质利用微生物生产蛋白质——单细胞蛋白 第一节 引言（Introducti

■ 蛋白质是构成生物体的基本物质。

病毒，细菌，激素，植物和动物细胞原生 质都是以蛋白质为基

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础的。

■ 酶是蛋白质 已经发现数以千计的酶。 ■ 蛋白质是由20种氨基酸构成的聚合物 一、蛋白质的分类： （一）根据组成分类

? 简单蛋白质（