氨基酸序列的测定方法

4.1 光度分析法[5] [6]

β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。 4.1.1试剂的配制：

缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc－HAc缓冲溶液 β-氨基丙酸标准溶液的配制：

用电子天平准确称取1.020 gβ-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L标准溶液。

茚三酮试剂的配制：称取0.5g茚三酮溶于100ml蒸馏水中，得到5g/L的茚三酮水溶液。

4.1.2标准曲线的确定

分别准确移取0.30ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、0.90ml、1.00ml标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml再加入1ml茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm下测其吸光度。以吸光

过程生化成分的变化

。

试验的初步结果看出

糖类物质中单糖是随氧化过程逐渐增加的分钟含量最高,。

,

淀粉和双糖却是不断儿茶素,、

减少

,

果胶指数是氧化

多酚类物质中,,

,

茶多酚总量。

、

黄酮类物质

都是随氧化时间延长而递减的化产物来看茶黄素氧化步结果。

与此相反,

非水溶性茶多酚却是不断增加的

从茶多酚的氧

一

分钟已达高峰

茶红素却不断增加分钟比较合适,

根据上述多种成份的变化

以及从茶黄素与茶红素的比例来看

酶性氧化

这是结合感观审评得出的初

茶叶中游离氨基酸的测定中国农科院茶叶研究所生理生化研究室近廿年来,氨基酸的分析方法有了很大的进展,

不仅操作精、

,

而且以全程自动化闻名

。

本文研究了茶叶中氨基酸的纸上层析分离法种氨基酸的关系,

,

利用单向层析

双向层析法从茶叶中分离出

,

并且进行了定性及定量工作。

,

对研究茶叶中氨基酸的组成与含量及其和茶叶品质

是一件必不可少的工作

方法如下取样品,,

一

,

用“

的帕甲酸水

肠乙醇提取

,

然后将过滤液蒸干加水以正丁醇,

进行点样肠乙醇

。

以正丁醇,冰醋酸水,

为展谱剂进行单向层析。

帕氨水。

二

酸相和正丁醇

作展谱剂进行双向层析

用苟三酮作为显色

剂

以纯品作对照确定各种氨基酸的位置进行定量

茶咖啡碱柱层分离测定法中国农科院茶叶研究所生理生化室茶样与氧化镁共热进行予热处理游离出咖

烟叶中游离氨基酸总量的测定

一、原理 游氨基酸可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物。在一定范围内，颜色的深浅游离氨基酸含

量成正比，可用分光光度计，在570nm下测得蓝紫色溶液的消光值，根据标准曲线计算未知样品中游离氨基酸的含量。 二、实验材料、仪器和试剂

1. 材料 新鲜烟叶 2. 仪器

（1）研钵、漏斗、三角瓶、滤纸 （2）具塞刻度试管20ml

（3）刻度吸管（5ml、1ml、移液枪0.1ml） （4）沸水浴电炉 （5）分光光度计 3. 试剂

（1）10％乙酸

（2）水合茚三酮试剂：称取0.6g茚三酮加入15ml正丙醇溶解，再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9mlpH4.5乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶于冰箱内保存，10日内有效。 （3）乙酸—乙酸钠缓冲液（PH4.5）：称取54g乙酸钠(NaAc·3H2O)，加入蒸馏水加热至沸，冷却后加30ml冰乙酸，用蒸馏水定容至100ml。

（4）氨基酸标准液：称取80℃烘干的亮氨酸46.8mg，以10％异丙醇溶解，并定容至100ml，取此液5ml用蒸馏水稀释至50ml，即为每毫升含氮5ug的标准液。 （5）0.1％的抗坏血酸：50mg溶于50ml水中，现用现

V5-tag

5ˊGGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG 3ˊ G K P I P N P L L G L D S T

6 X His tag

CAT CAT CAC CAT CAC CAT H H H H H H

S-tag AAA GAA ACC GCT GCT GCT AAA TTC GAA

CGC CAG CAC A TG GAC A GC

KETAAAKFERQHMDS

Flag-Tag GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG D Y K D D D D K

Myc-Tag GAG CAG AAA CTC ATC TCT GAA GAG GAT CTG E Q K L I S E E D L

HA-Tag TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT

V5-tag

5ˊGGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG 3ˊ G K P I P N P L L G L D S T

6 X His tag

CAT CAT CAC CAT CAC CAT H H H H H H

S-tag AAA GAA ACC GCT GCT GCT AAA TTC GAA

CGC CAG CAC A TG GAC A GC

KETAAAKFERQHMDS

Flag-Tag GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG D Y K D D D D K

Myc-Tag GAG CAG AAA CTC ATC TCT GAA GAG GAT CTG E Q K L I S E E D L

HA-Tag TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT

如有问题，欢迎请在群里询问。

1.准备工作：目标基因的全长，注意，把你的全长基因文本档另存为.seq格式结尾的文件，

如XXXX CDNA.SEQ，软件DNAman 8.0

2.打开DNAman，菜单sequence→load sequence→from sequence file，导入目标基因全长

3.导入后，你的目标基因就导入在左边All chanel中。双击XXX CDNA在右边框中打开

你的目标基因。

4.打开后如图所示。

5.点击菜单栏protein→translation，把上图的核苷酸序列翻译成氨基酸，设置如下

6.确定后，如下图。

7.这样，核苷酸就根据起始子的不同，被翻译成三种不同的核苷酸序列。根据目标基因的

ORF对比，确定目标基因正确的核苷酸序列。如上图，确定的正确核苷酸为第三列。

8.点击菜单栏protein→translation，选择Frame 3，同时可以输入数字调整每行氨基酸的显

示数目。一般为26。

9.调整后如图。

10. 鼠标在文本行左边点击会选择全行，按住鼠标不动，拖动，可以选择多行。

11.删除最上面的无用信息。如图。

12.确定目标基因的启动子，如图中的红色字体。然后把M之前的氨基酸序列选择，并删除。

13.再加入空格，调整回原来的

HPLC 的使用之一

氨基酸分析测定及衍生化方法

2

吕莹果1，，张　晖2，孟祥勇2，陈能飞3

（1. 河南工业大学粮油食品学院，　河南郑州　450001；2. 江南大学食品学院，　江苏无锡　214122；

3. 广州江大和风香精香料有限公司，　广东广州　510660）

摘　要：该文综述氨基酸分析方法进展和分类，并对柱前衍生化RP–HPLC分析氨基酸方法及常

用衍生化方法进行比较和探讨。关键词：氨基酸；衍生化；RP–HPLC

Methods for amino acid analysis and derivatization

2

LV Ying-guo1，，ZHANG Hui2，MENG Xiang-yong2，CHEN Neng-fei3

（1. College of Grain Oil and Food，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2. School of Food Science and Technology，Southern Yangtze University，Wuxi 214122，China；

3. Guangzhou ADD Co.， Ltd.， Guangzhou 51

蛋白质的酶促降解及氨基酸代谢

一.选择题

1．生物体内大多数氨基酸脱去氨基生成α-酮酸是通过下面作用完成的。( ) A.氧化脱氨基 B.还原脱氨基 C.联合脱氨基 D.转氨基 2．下列氨基酸中( )可以通过转氨作用生成α－酮戊二酸。 A.Glu B.Ala C.Asp D.Ser 3．转氨酶的辅酶是( )

A.TPP B.磷酸吡哆醛 C.生物素 D.核黄素 4．以下对L－谷氨酸脱氢酶的描述( )是错误的。 A.它催化的是氧化脱氨反应 B.它的辅酶是NAD或NADP

C.它和相应的转氨酶共同催化联合脱氨基作用 D.它在生物体内活力不强

5．鸟氨酸循环中，尿素生成的氨基来源有( )

A.鸟氨酸 B.精氨酸 C.天冬氨酸 D.瓜氨酸 6．磷酸吡哆醛可参与下面氨基酸的( )反应？

A.脱羧反应 B.消旋反应 C.氧化

蛋白质分解代谢

A型题：

1．生物体内氨基酸脱氨基的主要方式为： A．氧化脱氨基

B．还原脱氨基 C．直接脱氨基 D．转氨基 E．联合脱氨基

2．人体内氨的最主要代谢去路为： A．合成非必需氨基酸 B．合成必需氨基酸 C．合成NH4+随尿排出

D．合成尿素随尿排出 E．合成嘌呤、嘧啶、核苷酸等

3．转氨酶的辅酶组分含有：

A．泛酸 B．吡哆醛 C．尼克酸 D．核黄素 E．硫胺素

4．可经脱氨基作用直接生成α-酮戊二酸的氨基酸是：

A

非极性R基

Glycine Alanine Gly(G)

Ala(A)

Leucine Leu(L)

Methionine Met(M)

极性不带电荷R基

Serine Threonine Ser（S)

Thr(T)

Proline Asparagine Pro(P)

Asn(N)

Valine Val(V)

Isoleucine Ile(I)

Cysteine Cys(C)

Glutamine Gln(Q)

芳香R基

Phenylalanine Tyrosine Phe(F) Tyr(Y)

Tryptophan Trp(W)

带正电荷R基

Lysine

Arginine Lys (K)

Arg (R)

带负电荷R基

Histidine His (H)

Aspartic acid Asp (D)

Glutamic acid Glu (E)