Lowry法测定蛋白质含量

Lowry –Folin法测定食品中蛋白质的含量（测液体样品）

一、 实验目的 1、 2、

了解测定蛋白质的常用方法

掌握蛋白质含量测定的经典Lowry –Folin法。

二、 实验原理

在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色复合物。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定其蛋白质含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 三、 实验步骤 1、

标准曲线的绘制

（1） 取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、

0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相应的试管中，在各试管中分别加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20和0.00ml的蒸馏水，使总体积达到1.00ml。不同浓度BSA溶液的配置 编号 BSA（ml） 水（ml） BSA质量（μg）

（2） 取试剂A15.00ml，试剂B0.75ml和试剂C0.75ml，在50ml三角瓶中混

0（空白） 0 1.00 0 1 0.20 0.80 40 2 0.40 0.60 80 3 0.60

Lowry –Folin法测定食品中蛋白质的含量（测液体样品）

一、 实验目的 1、 2、

了解测定蛋白质的常用方法

掌握蛋白质含量测定的经典Lowry –Folin法。

二、 实验原理

在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色复合物。在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定其蛋白质含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 三、 实验步骤 1、

标准曲线的绘制

（1） 取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、

0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相应的试管中，在各试管中分别加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20和0.00ml的蒸馏水，使总体积达到1.00ml。不同浓度BSA溶液的配置 编号 BSA（ml） 水（ml） BSA质量（μg）

（2） 取试剂A15.00ml，试剂B0.75ml和试剂C0.75ml，在50ml三角瓶中混

0（空白） 0 1.00 0 1 0.20 0.80 40 2 0.40 0.60 80 3 0.60

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

(一)方法原理

样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。

(二) 仪器、设备

1. 仪器

分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。

2. 试剂

(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；

(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；

(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；

(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为

4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；

(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀,

黄豆中蛋白质含量测定——凯氏定氮法

一、仪器和试剂 主要仪器:

定氮仪。

试剂（除注明外均为分析纯）： 1. 浓硫酸。

2. 30%氢氧化钠溶液。 3. 2～4%硼酸溶液。 4. 0.1mol/L盐酸溶液。

5. 催化剂：硫酸钾——硫酸铜的混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3.5g:0.1g）。 二、操作步骤 1. 消化

准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.5g左右，小心移入干燥的消化瓶中（注意用称量纸将样品加入到消化管底部，勿粘附在瓶壁上），加入适量催化剂及10mL浓硫酸，按要求安装好消化装置后,设置好消化程序,打开冷凝水, 开始消化程序。(160℃, 40min; 250℃, 20min; 350℃, 60min; 420℃, 30min)消化程序结束后，消化至溶液透明呈蓝绿色，冷却至室温。同时做空白对照。 2． 蒸馏、吸收及滴定

按要求安装好UDK142蒸馏仪，并将蒸馏仪与自动电位滴定仪连接好。将所需试剂装到相应的试剂瓶中。设置好蒸馏程序及滴定程序后，将冷却好的消化管装到蒸馏仪上，打开冷凝水，然后开始程序。 三、结果计算

X?(V1?V2)?c?0.0140?F?100mX ——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g） C

凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量

马丹:凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量　57　　　　

凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量

KjeldahlDeterminationofProteinContent

马　丹

(勃利县质量技术监督局,黑龙江勃利154500)

摘　要:本文主要介绍了凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量的原理和实验过程中需要注意的一些问题。关键词:凯氏定氮;测定;食品;蛋白质

　　食品种类很多,食品中pro,而且其他成分,如碳水化合物很多,因此pro品消化成铵盐蒸馏,,用标准酸或碱液滴

定,由样品中含氮量计算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它们的基本原理都是一样的。

我们在检验食品中pro时,往往只限于测定总氮量,然后乘以pro核算等数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗pro。1　凯氏常量定氮法

:蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标

准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收,然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液,从而计算出总氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用标准盐酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影响指示剂变色反应,它有吸收氨的作用。1

黄豆中蛋白质含量测定——凯氏定氮法

一、仪器和试剂 主要仪器:

定氮仪。

试剂（除注明外均为分析纯）： 1. 浓硫酸。

2. 30%氢氧化钠溶液。 3. 2～4%硼酸溶液。 4. 0.1mol/L盐酸溶液。

5. 催化剂：硫酸钾——硫酸铜的混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3.5g:0.1g）。 二、操作步骤 1. 消化

准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.5g左右，小心移入干燥的消化瓶中（注意用称量纸将样品加入到消化管底部，勿粘附在瓶壁上），加入适量催化剂及10mL浓硫酸，按要求安装好消化装置后,设置好消化程序,打开冷凝水, 开始消化程序。(160℃, 40min; 250℃, 20min; 350℃, 60min; 420℃, 30min)消化程序结束后，消化至溶液透明呈蓝绿色，冷却至室温。同时做空白对照。 2． 蒸馏、吸收及滴定

按要求安装好UDK142蒸馏仪，并将蒸馏仪与自动电位滴定仪连接好。将所需试剂装到相应的试剂瓶中。设置好蒸馏程序及滴定程序后，将冷却好的消化管装到蒸馏仪上，打开冷凝水，然后开始程序。 三、结果计算

X?(V1?V2)?c?0.0140?F?100mX ——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g） C

实验八、蛋白质含量的测定

教学目的要求： 基本知识点

?1、掌握凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。

?2、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?3、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 ?4、掌数据处理和结果计算技术。

重点

?1、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?2、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 难点

凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。 课时教学方案： 复习与提问：

?1、检查实验准备情况，

?（1）实验内容；

?（2）实验仪器与试剂有哪些？

?（3）凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质程序。 ?2、凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理。 ?3、样品消化时应注意的事项。

?4、龙科－A型K氏定氮仪的工作原理与蒸馏操作方法。

实验八、蛋白质含量的测定

一、实验目的

1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理；

2、熟悉凯氏定氮法中样品的消化、蒸馏、吸收等基本操作技能； 3、熟练称量、溶液转移、滴定等基本操作技能。 二、实验原理

食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2

及H20逸去而氮以氨的形式与硫酸

凝胶层析法测定蛋白质分子质量

一、 实验目的

1、了解凝胶层析的原理及其应用。

2、通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、 实验原理

凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以