粗蛋白的测定

实验二饲料粗蛋白的测定

一、实验目的

通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握

半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。

二、实验原理

各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮（在一定处理下也包括硝酸态氨）都转

变成NH4+并与H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物质，则以CO2 ↑，H2O↑，SO2↑状态逸出。消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之

结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl标准溶液（0.1mol/L）滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用6.25系数计算），即为粗蛋白

质的含量。

其主要化学反应如下：

1、2NH4（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2（丙氨酸）

2、（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3+3H2O+2Na2SO4

3、4H3BO3+ NH 3→NH4HB4O7+5H2O

4、NH4HB4O7+HCl+5H2O→NH4C1+4H3BO3

本法不能区别蛋白氮和

粗蛋白含量的测定(凯氏定氮仪测定)

蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2 试剂及其配制

硫酸钾（分析纯）、五水硫酸铜（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、40%NaoH溶液（400g/L）、蒸馏水

0.1N盐酸标准溶液：量取9mL盐酸加适量水稀释至1000mL。

4%硼酸：取40g硼酸加水适量溶解后，定容至1000mL容量瓶中。

指示剂:甲基红0.1g，溴甲酚绿0.1g，混合定容至100ml 95%乙醇中，在滴定中加2~3滴于硼酸中。

3 仪器

消化炉、半自动凯氏定氮仪、天平（0.1mg、0.1g）

4 分析步骤

4.1 称1g(精确至0.1mmg)左右样品于消化管中；

4.2 加7g硫酸钾和0.8g五水硫酸铜；

4.3 加12mL浓硫酸，慢慢地摇动，将样品用酸浸湿；

4.4 将涤气装置接在支架中的消化管上，将水抽气泵水龙头全开；

4.5 将装有涤气装置的消化管连支架放入消化器中；

4.6 5min后调小抽气泵水流，使酸恰好吸入涤气罩头；

4.7 继续消化直至全部样品变为透

粗蛋白含量的测定(凯氏定氮仪测定)

蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

1 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2 试剂及其配制

硫酸钾（分析纯）、五水硫酸铜（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、40%NaoH溶液（400g/L）、蒸馏水

0.1N盐酸标准溶液：量取9mL盐酸加适量水稀释至1000mL。

4%硼酸：取40g硼酸加水适量溶解后，定容至1000mL容量瓶中。

指示剂:甲基红0.1g，溴甲酚绿0.1g，混合定容至100ml 95%乙醇中，在滴定中加2~3滴于硼酸中。

3 仪器

消化炉、半自动凯氏定氮仪、天平（0.1mg、0.1g）

4 分析步骤

4.1 称1g(精确至0.1mmg)左右样品于消化管中；

4.2 加7g硫酸钾和0.8g五水硫酸铜；

4.3 加12mL浓硫酸，慢慢地摇动，将样品用酸浸湿；

4.4 将涤气装置接在支架中的消化管上，将水抽气泵水龙头全开；

4.5 将装有涤气装置的消化管连支架放入消化器中；

4.6 5min后调小抽气泵水流，使酸恰好吸入涤气罩头；

4.7 继续消化直至全部样品变为透

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凯氏定氮仪在测定饲料粗蛋白的注意细节和操作步骤

凯氏定氮仪又叫定氮仪，是以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法，是国际上通用的标准方法，操作简单，测定结果重复性和重现性都很好，广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度，认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项，就显得极为重要。

一、试样的粉碎

测定要求样品粉碎并全部过40目筛，目的在于使其具备均质性，便于溶样，更易于消化。但也须掌握以下四点：（1）由于粉碎或过筛过程中，样品容易产生自动分级，如玉米，其硬质部分常聚集在上面，软质部分聚在下面。所以粉碎过筛后要重新混合均匀，以减少测量误差；（2）粉碎完后，粉碎机中总会遗留少部分，这部分不能随便丢弃，否则将影响样品的均质性；（3）粉碎过程要快，以避免样品的成分变化；（4）对于全价料(即使是颗粒全价料)和浓缩料，无须再粉碎，当然这是基于混合机的良好混合均度的；如果拿去粉碎，会丢失部分粉末物质，且粉碎后产生分级，反而降低了样品的均质性。

二、试样的用量

试样的用量可根据情况而定，标准法中规定为0．5～1g，这个用量对于浓缩料、鱼粉、豆粕等高蛋

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（一）——紫外吸收测定

【实验目的】

了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 掌握紫外分光光度计的使用方法。 【实验原理】

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。

【实验器材与材料】

（一）试剂

1、标准蛋白溶液

牛血清蛋白预先经凯式定氮法测定蛋白氮

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（一）——紫外吸收测定

【实验目的】

了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 掌握紫外分光光度计的使用方法。 【实验原理】

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。

【实验器材与材料】

（一）试剂

1、标准蛋白溶液

牛血清蛋白预先经凯式定氮法测定蛋白氮

蛋白浓度测定

蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。

蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法

化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法

蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method)

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用过量标准HCl吸收

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method)

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用过量标准HCl吸收