土壤纤维素酶活性测定方法

*33*年第"-期中国饲料

—*-—

纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

"

!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

-*"型分光光度计、

恒温水浴锅、./0%*酸度计、

秒表。")")1

试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678

磷酸氢二钠液（称取-)

*33*年第"-期中国饲料

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纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

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!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

-*"型分光光度计、

恒温水浴锅、./0%*酸度计、

秒表。")")1

试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678

磷酸氢二钠液（称取-)

*33*年第"-期中国饲料

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纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

"

!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

-*"型分光光度计、

恒温水浴锅、./0%*酸度计、

秒表。")")1

试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678

磷酸氢二钠液（称取-)

生物化学实验报告

题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）

姓名： 学号： 班级： 时间：

一、

实验目的：

掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。

二、

实验原理：

纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 三、

实验试剂：

1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，

加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4. 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，

此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。

5. 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待

测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）

四、

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验

一、实验目的

1、了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、掌握液体发酵和固体发酵工艺

3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、实验原理

纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。

以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。 三、材料与试剂配制

1、生产菌种：黑曲霉

2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。

3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2 O = 7.0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH2PO4 = 2.0 g/ L ;N

实验原理

植物的主要化学成分是纤维素、半纤维素和木质素这三部分。它们是构成植物细胞壁的主要组分。其中，纤维素组成微细纤维，构成纤维细胞壁的网状骨架，而半纤维素和木质素是填充在纤维和微细纤维之间的“粘合剂”和“填充剂”。 1. 纤维素

生物制粉末在加热的情况下用醋酸和硝酸的混合液处理，在这种情况下，细胞间的物质被溶解，纤维素也分解成单个的纤维，木质素、半纤维素和其它的物质也被除去。淀粉、多缩戊糖和其它物质受到了水解。用水洗涤除去杂质以后，纤维素在硫酸存在下被重铬酸钾氧化成二氧化碳和水。

C6H10O5 + 4K2Cr2O7 + 16H2SO4 = 6CO2 + 4Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 21H2O

过剩的重铬酸钾用硫酸亚铁铵溶液滴定，再用硫酸亚铁铵滴定同量的但是未与纤维素 反应的重铬酸钾，根据差值可以求得纤维素的含量。 2. 半纤维素

用沸腾的80％硝酸钙溶液使淀粉溶解，同时将干扰测定半纤维素的溶于水的其它碳水化合物除掉。将沉淀用蒸馏水冲洗以后，用较高浓度的盐酸，大大缩短半纤维素的水解时间，水解得到的糖溶液，稀释到一定体积，用氢氧化钠溶液中和，其中的总糖量用铜碘法测定。

铜