PCR会议
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2016年PCR会议日程表-0707
2016年重庆市临床基因扩增检验室间质评总结会暨上岗培训班
会议日程安排表
日 期 8月 23日 8月 24日 15:00～19:00 18:00～19:00 8:30～9:20 9:20～10:10 10:10～10:20 内 容 代表报到，领取会议资料 晚 餐 （地点：宾馆三楼） 开班仪式 临床基因扩增技术的基本原理与应用 PCR试剂、耗材的质检和主要仪器设备的校准及维护 茶 歇 重庆医科大学 张彦 教授 四川省人民医院 杜琼 主任 大坪医院 邓少丽 教授 重庆市临床检验中心 田华 主任技师 主 讲 10:20～11:10 PCR检测系统性能评价及性能验证 11:10～12:00 PCR实验室的设置、生物安全及防污染措施 12:00～12:30 14:00～14:50 午 餐 （地点：宾馆三楼） 血站核酸实验室质量管理规范及输血传播病原体检测方法概要 中国科学院输血研究所 何苗 博士 华大基因 华大基因 维护 西南医院 杨再林 硕士 14:50～15:40 基因测序技术的基本原理与应用 15:40～15:50
DMSO in PCR
1. 如果要增加特异性，要考虑是否升温，复性时候的较高温度有利于筛选特定片段，减少其他GC丰富片段的竞争。
2. 考虑使用甘油：加甘油也可以的,一般终浓度在10%左右.我的实验也曾遇到过GC高达73%的情况,加过甘油非特异性改善了很多,你不妨试一下.
3. 使用甜菜碱：
DMSO can usually give results in GC-rich regions when used at a final
concentration of 5%, although there are reports in the literature of
genes which required 10% DMSO, so a bit of experimentation may be
necessary to optimise the concentration for your genes. Alternatively,
addition of Betaine to concentrations of 1M in reactions can also be
beneficial in GC-rich regions.
There was a comparison pub
PCR步骤
RT-PCR实验步骤
一、总RNA提取
1）试剂配制
1. 0.1TPC水：1000mL双蒸水中加入1mLDEPC，室温下静置4小时。（①用来泡使用
器具处理12小时；②在120℃下高压灭菌30分钟后室温放置备用用来溶解RNA。） 2. 氯仿 3. 异丙醇
4. 75%乙醇：用无水乙醇和高压后的DPEC水配制，现配现用。
2）操作步骤：
1. 样品处理
a. 组织：将组织放在液氮中磨碎（低温处理）。每50-100mg组织加1mL裂解液TRZOL，
用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液TRZOL体积的十分之一。 b. 单层培养细胞；直接在培养板上加入裂解液TRZOL裂解细胞，每10cm2面积加1mL
TRZOL。用取样器抽打几次。（注意：裂解液RZ的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。）
c. 细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每5-10×106动物细胞和植物细胞加入1mL裂解液RZ。
加裂解液RZ前不要洗涤细胞，以免降解RNA。
d. 血液：直接取新鲜血液，加入3倍体积RZ（推荐0.25mL血液+0.75mLRZ），充分震荡
混匀。
2. 将裂解样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白质复合
有关PCR习题
一、选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（ ）
A．Taq DNA聚合酶 B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶 E．合适pH缓冲液 2．以下哪种酶可耐高温（ ）
A．Taq DNA聚合酶 B．Hind Ⅲ C．T4连接酶 D．RNA酶 E．Klenow片段 3．PCR反应正确过程应为（ ）
A．退火→变性→延伸 B．变性→退火→延伸 C．退火→延伸→变性 D．变性→延伸→退火E．延伸→变性→退火
4． PCR技术的本质是（ ）
A． 核酸杂交技术 B． 核酸重组技术C． 核酸扩增技术 D． 核酸变性技术 E． 核酸连接技术 5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（ ）
A．37℃ B．50℃～55℃ C．70℃～75℃ D．80℃～85℃ E．94℃～95℃ 6．能在细胞内进行PCR扩增的PCR仪为（ ）
A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光PCR仪 E．实时PCR仪 7．在下列哪种PCR仪扩增样品可以了解样品中DNA原始拷贝数（ ）
A．普通PCR仪 B．梯度PCR仪 C．原位PCR仪 D．荧光实时PCR仪E．定性PCR仪 8．
PCR试题要点
【A型题】 在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（ ）
A．Taq DNA聚合酶 B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶 E．合适pH缓冲液 2．以下哪种酶可耐高温（ ）
A．Taq DNA聚合酶 B．Hind Ⅲ C．T4连接酶 D．RNA酶 E．Klenow片段
3．PCR反应正确过程应为（ ）
A．退火→变性→延伸 B．变性→退火→延伸 C．退火→延伸→变性 D．变性→延伸→退火 E．延伸→变性→退火 4． PCR技术的本质是（ ）
A． 核酸杂交技术 B． 核酸重组技术
C． 核酸扩增技术 D． 核酸变性技术 E． 核酸连接技术
5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（ ）
A．37℃ B．50℃～55℃ C．70℃～75℃ D．80℃～85℃ E．94℃～95℃
6．温度均一性较好的PCR仪为（ ）
A．水浴锅PCR基因扩增仪和压缩机PCR基因扩增仪 B．半导体PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 C．压缩机PCR基因扩增仪和半导体PCR基因扩增仪 D．压缩机PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 E．水浴锅PCR基因扩增仪和离心式空气加热
PCR引物设计要点
PCR引物设计要点
1. 书写规则
设计引物时，5’端引物与目的序列正义链相同，而3’端引物则与目的序列正义链互补，书写时从引物的5’端至3’端（即5’端引物不变，3’端引物与目的序列互补并相反）； 2. 引物长度
一般引物长度为18~30碱基（不包括5’端添加的修饰），引物太长和太短都不好； 3. GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不应超过3个连续的G或C。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大； 4. 退火温度
可以用软件PrimePrimer来计算退火温度，在引物短于20bp时，可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度)，有效引物的Tm为55~65℃之间较好，如果待扩增基因的GC含量较高（超过50%），引物的退火温度可设计得高一点，例如接近65℃，因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。一对引物的退火温度应尽量接近，相差范围应在5℃之内；
一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃，如果扩不出，可试着将退火温度降低5℃ 和升高5℃再试一下，但一般不要1℃ 1℃升，或1℃ 1℃
临床PCR实验攻略
临床PCR实验攻略
? 基础篇
一、如何选择试剂，评价试剂是否符合自己实验室条件？
现在临床PCR实验室使用的试剂大部分都是各生产企业提供的商品化的试剂盒，那么试剂质量的好坏直接决定了实验结果的好坏，而不同厂家试剂的性能、质量和价格千差万别，如何选择一款合适的试剂对每个PCR实验室都至关重要，一般来说，选择试剂主要从以下几个方面进行评价： 1、重复性
首先，试剂检测结果的重复性直接展现了试剂的方法学及其质量的好坏，是评价试剂好坏最明显、最直接的指标。
其次，我们在此说的试剂重复性是指对原始样本检测的重复性，而不是对某一个样本提取的核酸进行重复性的检测和评价。
最后，试剂的重复性对于疗效检测、用药指导有着重大的意义，一个重复性好的试剂，往往能够在病人的抗病毒治疗过程中，给医生和病人提供最直接、最可靠的数据，让医生和病人对疾病进展有更清楚的认识，从而制定合理的治疗方案，实现更好的治疗效果。 2、灵敏度
一个试剂的灵敏度往往能够体现该试剂的技术水平和先进程度，同时对于临床病症的监测有着举足轻重的意义。以乙肝为例来说，我国的乙肝复发率远远大于发达国家，同时由乙肝病毒感染转换为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，这很大程度上与对低载量病毒监控的严
PCR问题解析
如何防止PCR形成引物二聚体？
在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？
答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。
PCR模板大约在104-106个拷贝。
答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。
答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；
3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的； 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%
PCR自测题
PCR自测题
一、名词解释 1.PCR 2.变性 3.退火 4.延伸 5.逆转录PCR 6.停滞效应 7.共享引物PCR 8.多重PCR 9.反向PCR 10.原位PCR 11.LCR
二、单项选择题
1．PCR反应中，所设计引物的长度一般为（ ）
A．5～10核苷酸 B. 15～30核苷酸 C. <50个核苷酸 D.长度任意 E. 以上答案均不对
2．引物设计时G＋C含量在引物中一般占（ c ）
A. 20～40﹪ B. 30～60﹪ C. 45～55﹪ D.越高越好 E.含量随意 3．以下说法错误的是（ e ）
A 引物中的碱基组成应该尽可能的随机分布。 B 引物自身不应该存在互补序列
C 设计引物时应考虑使3?端引物和5?端引物具有相似的Tm值 D 引物的5?和3?端必须和模板严格配对结合
E 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70﹪ 4．下列说法正确的是（ ）
C. PCR反应常用的缓冲液为10－50mmol/L的Tris-HCl（室温 PH 8.3－8.8） D. 10mmol/L的KCl能促进引物的退火 E. 加入
PCR技术及其应用
第八章 PCR技术及其应用
PCR技术的建立① Khorana(1971)等提出在体外经 DNA变性,与适当引物杂交,再用 DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设 想—―修复复制”但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
②
1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现
Mullis的构思引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
③
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术
Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus)100
酶 80 活 性 6040
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
Kary B. Mullis <