病毒tcid50测定方法
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病毒TCID50测定
病毒TCID50测定
操作步骤 (1) 准备细胞
取出一块细胞培养板,每个孔大约传8000~10000个细胞(一个T25瓶的细 胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板,要传匀)。每个孔的细胞铺成单层大约60%丰度即可接种病毒(下午传好板第二天早上就能用)。
细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行,操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行,但要保证实验条件一致。 (2) 稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法 B法参照书将液体量减少后的结果
病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体,无论哪种都无血清。
A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒,依次10倍系列稀释至适宜浓度,最后一支试管。
B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1,10-2…10-10等),根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒,常规每个稀释度接种4孔,则每个稀释度配500μl,即10-1为50μl加入450μl的孵育液中;如每个稀释度接种8个孔,则各配制1ml,即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔,则相应增加液
病毒TCID50测定方案
TCID50测定方案
2012112339
1 简介
TCID50(Tissue Culture Infective Dose),半数组织培养感染量,又称50%组织细胞感染量,指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathic effect,CPE)的病毒量。
将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变,待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数,按照Reed-Muench公式计算TCID50值。
2 试剂
试剂
DMEM-basic培养基 胰蛋白酶
胎牛血清Fetal bovine serum PBS
来源 Gibco,上海 Gibco, Hyclone, Hyclone,
保存条件 4℃保存 -20℃冻存 -20℃冻存 -20℃冻存
3 仪器与耗材
仪器
CO2培养箱 生物安全柜 倒置显微镜 显微照相系统 高速冷冻离心机 电子天平 移液器 液氮罐 电冰箱
规格
耗材 细胞培养瓶 无菌离心管 一次性移液管 细胞培养板
规格
25cm2
15mL,50mL
1mL,2mL,5mL,10mL 96孔
4 细胞及培养基
DF-1细胞株
细胞
TCID50的测定方法 -
实验 病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
滴度:在半定量或定量测定中,将标本作一系列稀释后进行试验,呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低,可以判断标本反应性的强弱。 滴度(抗体的多少)越高,受传染的机会就越小。
一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD50( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测
半数细胞培养物感染量TCID50(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测 蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU):用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液(PRV) TCID50的操作步骤
1) 准备细胞
取出一块细胞培养板,每个孔大约传8000~10000个细胞(一个T25瓶的细
胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板,要传匀)。每个孔的细胞铺成单层
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
概念:半数感染量(median infective dose, ID50) 表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD50( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测
蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU):用细胞来检测 三、材料
1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液(PRV) 四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释,从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中,每一稀释度接种一纵排共8 孔,每孔接种100μl
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
概念:半数感染量(median infective dose, ID50) 表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD50( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测
蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU):用细胞来检测 三、材料
1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液(PRV) 四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释,从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中,每一稀释度接种一纵排共8 孔,每孔接种100μl
TCID50和PFU的换算公式
1、PFU:plaque forming unit,空斑形成单位:感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差,因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50法。
2、MOI :multiplicity of infection,感染复数:传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量的比值。
然而,由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量,因此其MOI的含义与传统的概念相同。传统意义上的MOI的测定,其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件,遵循Poisson分布规律,可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数(MOI)。其公式为:
P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP(0)。 其中
TCID50,EID50等数据的计算(可打印修改)
中和试验
动物受到病毒感染后,体内产生特异性中和抗体,并与相应的病毒粒子呈现特异性结合,因而阻止病毒对敏感细胞的吸附,或抑制其侵入,使病毒失去感染能力。中和试验
(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础,以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据,来判定免疫血清中和病毒的能力。
中和试验常用的有两种方法:一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合,另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合;然后把血清-病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后,接种于敏感细胞、鸡胚或动物,测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡,说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量,故中和试验可应用于:
1.病毒株的种型鉴定:中和试验具有较高的特异性,利用同一病毒的不同型的
毒株或不同型标准血清,即可测知相应血清或病毒的型,所以,中和试验不但可以定属而且可以定型。
2.测定血清抗体效价:中和抗体出现于病毒感染的较早期,在体内的维持时间
较长。动物体内中和抗体水平的高低,可显示动物抵抗病毒的能力。
3.分析病毒的抗原性。
毒素和抗毒素亦可进行中和
测定方法
一、茶叶中水浸出物的测定
水浸出物是指在规定的条件下,用沸水萃取茶叶中的可溶性物质。
1 原理 用沸水萃取茶叶中的可溶性物质,再经过滤、蒸发至干,称量残留物。 2 仪器和用具 实验室常规仪器及下列各项: 2.1 鼓风电热恒温干燥箱:温控103±2℃。 2.2 恒温水浴。
2.3 具盖蒸发皿:直径60mm,高50mm,容量80mL。 2.4 干燥器,内盛有效干燥剂。 2.5 分析天平:感量0.001g。 2.6 容量瓶:500mL。 2.7 锥形瓶:500mL。 3 操作方法
3.1 取样 按照GB 8302-87《茶 取样》的规定取样。
3.2 试样制备 按照GB 8303-87 《茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》的规定,制备试样。
3.3 蒸发皿的准备 将具盖蒸发皿(2.3)置于103±2℃的恒温干燥箱(2.1)内,烘干1h,取出,在干燥器内(2.4)冷却至室温,称量(精确至0.001g)。 3.4 测定步聚
3.4.1 试液的制备 称取3g(准确至0.001g)磨碎试样(3.2)于500mL锥形瓶(2.7)中,加沸蒸馏水450mL,立即 移入沸水浴(2.2)中,浸提45min*(每隔10min摇动一次)。浸提完毕后立即趁热减
COD测定方法
化学需氧量
化学需氧量(COD),是指在一定条件下,用强氧化剂处理水样时所消耗氧化剂的量,以氧的毫克/升来表示。化学需氧量反映了水中受还原性物质污染的程度。水中还原性物质包括有机物、亚硝酸盐、亚铁盐、硫化物等。水被有机物污染是很普遍的,因此化学需氧量也作为有机物相对含量指标之一。
水样的化学需氧量,可受加入氧化剂的种类及浓度,反应溶液的酸度,反应温度和时间,以及催化剂的有无而获得不同的结果。因此,化学需氧量亦是一个条件性指标,必须严格按操作步骤进行。对于工业废水,我国规定用重铬酸钾法,其测得的值称为化学需氧量。
(一)
重铬酸钾法(CODCr)
GB11914--89概述 1.原 理
在强酸性溶液中,一定量的重铬酸钾氧化水样中还原性物质,过量的重铬酸钾以试亚铁灵作指示剂、用硫酸亚铁铵溶液回滴。根据用量算出水样中还原性物质消耗的量。
2.干扰及其消除
酸性重铬酸钾氧化性很强,可氧化大部分有机物,加入硫酸银作催化剂时,直链脂肪族化合物可完全被氧化,而芳香族有机物却不易被氧化,吡啶不被氧化,挥发性直链脂肪族化合物、苯等有机物存在于蒸气相,不能与氧化剂液体接触,氧化不明显。氯离子能被重铬酸盐氧化,并且能与硫酸银作用产
水质测定方法
在本实验中,需要测定废水的主要指标包括:TP、TN、NH3-N、COD、pH以及浊度,用到的测定方法都是依照《水和废水监测分析方法(第四版)[26]。
(1)TP的测定
实验中主要考察的水质指标是水中磷的含量,其分析方法严格按照《水和废水监测分析方法(第四版)进行,采用钼酸盐分光光度法测定(GB-11893-89)。
实验的测定的原理是:在酸性的条件下,正磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑氧钾反应,生成磷钼杂多酸,被还原剂抗坏血酸还原,则变成蓝色络合物,通常成为磷钼蓝。在测定中需要的试剂包括:
①(1+1)硫酸;
②10%抗坏血酸溶液:溶解10g抗坏血酸溶于水,并稀释至1000mL; ③钼酸盐溶液:溶解13g钼酸铵于100mL水中,溶解0.35g酒石酸锑氧钾于100mL水中,在不断的搅拌下,将钼酸铵溶液徐徐加到300mL(1+1)硫酸,加酒石酸锑氧钾溶液并且混合均匀。储存在棕色的玻璃瓶里在4℃保存;
④浊度-色度补偿液:混合两份体积的(1+1)硫酸和一份体积的10%抗坏血酸溶液;
⑤磷酸盐储备液:将优级纯磷酸二氢钾于110 ℃干燥两个小时,在干燥器中放冷。称取0.2197g溶于水,移入1000mL容量瓶中,加(1+1)硫酸5mL,用水稀释至标线。此溶液