病毒tcid50测定方法

病毒TCID50测定

操作步骤 (1) 准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细 胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。 (2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法 B法参照书将液体量减少后的结果

病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500μl，即10-1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液

TCID50测定方案

2012112339

1 简介

TCID50(Tissue Culture Infective Dose)，半数组织培养感染量，又称50%组织细胞感染量，指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(Cytopathic effect，CPE)的病毒量。

将不同稀释度的病毒接种到96孔板上培养的单层细胞上。观察细胞病变，待细胞不再病变时记录每个稀释度出现病变和未出现病变的孔数，按照Reed-Muench公式计算TCID50值。

2 试剂

试剂

DMEM-basic培养基 胰蛋白酶

胎牛血清Fetal bovine serum PBS

来源 Gibco，上海 Gibco， Hyclone， Hyclone，

保存条件 4℃保存 -20℃冻存 -20℃冻存 -20℃冻存

3 仪器与耗材

仪器

CO2培养箱 生物安全柜 倒置显微镜 显微照相系统 高速冷冻离心机 电子天平 移液器 液氮罐 电冰箱

规格

耗材 细胞培养瓶 无菌离心管 一次性移液管 细胞培养板

规格

25cm2

15mL，50mL

1mL，2mL，5mL，10mL 96孔

4 细胞及培养基

DF-1细胞株

细胞

实验 病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

滴度：在半定量或定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱。 滴度（抗体的多少）越高，受传染的机会就越小。

一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测

三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） TCID50的操作步骤

1) 准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细

胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层

病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

概念：半数感染量（median infective dose， ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl

病毒感染力的滴定（TCID50的测定）

概念：半数感染量（median infective dose， ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。 一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。 二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物(tissue,组织)感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测

蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测 三、材料

1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV） 四、TCID50的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl

1、PFU:plaque forming unit，空斑形成单位：感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50法。

2、MOI :multiplicity of infection，感染复数：传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。传统意义上的MOI的测定，其原理是基于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数（MOI）。其公式为：

P = 1- P(0) ,P(0) = e-m 或m = -InP（0）。 其中

中和试验

动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试验

(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照(指仅接种病毒的宿主)一样地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量，故中和试验可应用于：

1.病毒株的种型鉴定：中和试验具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的

毒株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试验不但可以定属而且可以定型。

2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的较早期，在体内的维持时间

较长。动物体内中和抗体水平的高低，可显示动物抵抗病毒的能力。

3.分析病毒的抗原性。

毒素和抗毒素亦可进行中和

一、茶叶中水浸出物的测定

水浸出物是指在规定的条件下,用沸水萃取茶叶中的可溶性物质。

1 原理 用沸水萃取茶叶中的可溶性物质,再经过滤、蒸发至干,称量残留物。 2 仪器和用具 实验室常规仪器及下列各项： 2.1 鼓风电热恒温干燥箱：温控103±2℃。 2.2 恒温水浴。

2.3 具盖蒸发皿：直径60mm,高50mm,容量80mL。 2.4 干燥器,内盛有效干燥剂。 2.5 分析天平：感量0.001g。 2.6 容量瓶：500mL。 2.7 锥形瓶：500mL。 3 操作方法

3.1 取样 按照GB 8302-87《茶 取样》的规定取样。

3.2 试样制备 按照GB 8303-87 《茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》的规定,制备试样。

3.3 蒸发皿的准备 将具盖蒸发皿(2.3)置于103±2℃的恒温干燥箱(2.1)内,烘干1h,取出,在干燥器内(2.4)冷却至室温,称量(精确至0.001g)。 3.4 测定步聚

3.4.1 试液的制备 称取3g(准确至0.001g)磨碎试样(3.2)于500mL锥形瓶(2.7)中,加沸蒸馏水450mL,立即 移入沸水浴(2.2)中,浸提45min*(每隔10min摇动一次)。浸提完毕后立即趁热减

化学需氧量

化学需氧量（COD），是指在一定条件下，用强氧化剂处理水样时所消耗氧化剂的量，以氧的毫克/升来表示。化学需氧量反映了水中受还原性物质污染的程度。水中还原性物质包括有机物、亚硝酸盐、亚铁盐、硫化物等。水被有机物污染是很普遍的，因此化学需氧量也作为有机物相对含量指标之一。

水样的化学需氧量，可受加入氧化剂的种类及浓度，反应溶液的酸度，反应温度和时间，以及催化剂的有无而获得不同的结果。因此，化学需氧量亦是一个条件性指标，必须严格按操作步骤进行。对于工业废水，我国规定用重铬酸钾法，其测得的值称为化学需氧量。

（一）

重铬酸钾法（CODCr）

GB11914--89概述 1．原 理

在强酸性溶液中，一定量的重铬酸钾氧化水样中还原性物质，过量的重铬酸钾以试亚铁灵作指示剂、用硫酸亚铁铵溶液回滴。根据用量算出水样中还原性物质消耗的量。

2．干扰及其消除

酸性重铬酸钾氧化性很强，可氧化大部分有机物，加入硫酸银作催化剂时，直链脂肪族化合物可完全被氧化，而芳香族有机物却不易被氧化，吡啶不被氧化，挥发性直链脂肪族化合物、苯等有机物存在于蒸气相，不能与氧化剂液体接触，氧化不明显。氯离子能被重铬酸盐氧化，并且能与硫酸银作用产

在本实验中，需要测定废水的主要指标包括：TP、TN、NH3-N、COD、pH以及浊度，用到的测定方法都是依照《水和废水监测分析方法（第四版）[26]。

（1）TP的测定

实验中主要考察的水质指标是水中磷的含量，其分析方法严格按照《水和废水监测分析方法（第四版）进行，采用钼酸盐分光光度法测定（GB-11893-89）。

实验的测定的原理是：在酸性的条件下，正磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑氧钾反应，生成磷钼杂多酸，被还原剂抗坏血酸还原，则变成蓝色络合物，通常成为磷钼蓝。在测定中需要的试剂包括：

①（1+1）硫酸；

②10%抗坏血酸溶液：溶解10g抗坏血酸溶于水，并稀释至1000mL； ③钼酸盐溶液：溶解13g钼酸铵于100mL水中，溶解0.35g酒石酸锑氧钾于100mL水中，在不断的搅拌下，将钼酸铵溶液徐徐加到300mL（1+1）硫酸，加酒石酸锑氧钾溶液并且混合均匀。储存在棕色的玻璃瓶里在4℃保存；

④浊度-色度补偿液：混合两份体积的（1+1）硫酸和一份体积的10%抗坏血酸溶液；

⑤磷酸盐储备液：将优级纯磷酸二氢钾于110 ℃干燥两个小时，在干燥器中放冷。称取0.2197g溶于水，移入1000mL容量瓶中，加（1+1）硫酸5mL，用水稀释至标线。此溶液