southern杂交技术

分 子 植 物 病 理 学 实 验

--Southern杂交

（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）

核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等 ）

Southern杂交

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检

Southern Blotting技术总结

Southern Blotting溶液的配制： ※、变性缓冲液

1.5M NaCl 0.5M NaOH ※、中和缓冲液

1.5M NaCl 1.0 MTris?HCl Tris,HCl调pH8.0 ※、20×SSC 1L

3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0) ※、2×SSC:

0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0) ※、洗膜液Ⅰ的配制： 2×SSC，0.1%SDS ※、洗膜液Ⅱ的配制： 0.5×SSC，0.1%SDS ※、Washing Buffer:

0.1 M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）,0.3%(V/V) Tween ※、Maleic Acid Buffer：0.1M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5） ※、1×Blocking Solution：10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍（现配现用）；

※、Antibody solution:每次使用前，4℃,10000rpm

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核酸分子杂交技术

南昌大学第二附属医院：黄波

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核酸分子杂交技术的基本原理 按碱基互补配对原则，具有一定同源性 的两条核苷酸单链在适宜条件下形成双链 杂交过程具有高度特异性(即使有一个 碱基不配对都不能杂交)。 通过检测探针是否发生了杂交及杂交量 多少，从而对待测核苷酸序列进行定性和 定量分析。 核酸分子杂交的成败，关键在于探针。

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变性

复性

DNA-DNA 杂交双链分子

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(一)探针的概念、种类及其选择、探针的标记

1.探针的概念： 在化学及生物学意义上的探针(Probe),是指 能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子， 并可被特殊的方法所探知 核酸分子探针则是指带有标记物，能与互补核 酸序列退火杂交的特定已知核酸片段。 探针的设计和选择影响核酸杂交实验结果的高 度特异性、正确性。

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2.探针的种类、选择及特点 种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探

针、寡核苷酸探针选择：寡核苷酸探针是指人工合成的

农业,技术

西瓜杂交制种技术操作要点

随着杂交西瓜品种的不断推陈出新，西瓜杂交制种在农村许多地方已经发展成为一项重要产业，但是，由于种种原因，种子产量和质量的提高一直困扰着该项产业的高速发展。经过多年来的制种实践，我们总结出一套技术操作方法，现介绍如下：

一、播前准备

（一）、基地及地块 制种基地选择气候适宜并具有一定生产基础，能保证西瓜杂交制种所需要的地块、水源、生产资料和劳动力的村庄；选择与其它西瓜田隔离1000米以上，耕层深厚、通透性好、排灌方便，7～8年内未种过葫芦科作物，常年无毁灭性灾害的地块作为制种田。

制种田要求冬前深耕30厘米，耕后不耙，早春解冻后进行春汇，然后复耕，结合翻地，每亩施有机肥3000～4000公斤，过磷酸钙50公斤，硫酸钾15公斤，混合施入，然后整地作畦。

（二）、种子处理 根据亲本种子的粒型、颜色、形状、大小、花纹等特征进行清选，保证原种整齐一致。将整理好的种子放入55～60℃的温水中，适当搅动，15分钟后取出，然后用清水淘净控干。将上述种子拌入种子量5倍的湿润的河沙或沙土中，装入瓦钵或其它

农业,技术

器皿内，置于30～35℃条件下催芽，约40小时大部分芽尖露出后即可播种。

二、播种

（一）栽培方式 为尽早采收种子，便于秋

第二章 核酸杂交技术

（一）名词解释 1．原位杂交

2．核酸分子杂交技术 3．探针 4．反向点杂交 5．缺口平移标记法 6．随机引物标记法 7．末端标记法

8．Southern blot杂交 9．荧光原位杂交 10．菌落杂交 （二）选择题 【A型题 】

1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（A G－C含量 B A－T含量 C A－G含量 D A－C含量 E T－G含量

2．液相杂交是下列哪一种（ ） A Southem印迹杂交 B Northem印迹杂交 C Dot印迹杂交 D Slot印迹杂交 E RPA实验

3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（ ） A 菌落杂交 B Southern杂交 C Northern杂交 D 液相杂交

E 原位杂交

4．Southern杂交通常是指（ ） A DNA和RNA杂交 B DNA和DNA杂交 C RNA和RNA杂交 D 蛋白质和蛋白质杂交 E DNA和蛋白质杂交

5．最容易降解的核酸探针是( ) A cDNA探针

B dsDNA探针 C ssDNA探针 D gDNA探针 E: RNA

6．探针基因芯片技术的本质就是

核酸的分子杂交技术

一、核酸分子杂交

用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

二、核酸分子杂交的分类

液相杂交

核算分子杂交 印记杂交

固相杂交

原位杂交

1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。 2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。

常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭

缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。

三、核酸分子杂交的基本原理 1、变性：

在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。 ﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

﹡变

杂交玉米制种技术

一、技术种植规程

1、安全隔离：:隔离距离300米以上，隔离范围内出现杂玉米坚决砍除，要求集申连片种植。

2、播种： (1)错期：父母本错期13 天左右，母本种后13天种父本 (以母本种子泡水时间计算)。 (2)最佳播种时间：4月25日至5月15日，力争播期集中；依靠雨水播种的田块则必须下透雨后，及时集中播种。

(3)播种量：父本1公斤/亩，母本4公斤/亩。足数下种，确保一次全苗。剩余亲本种子严禁拿到片外种植，一经发现，无条件砍除并追究其相应责任。 3、种植规格及方法：实行塘播或条播

(1)父母本行比：1：6。

(2)父本：小墒种植，2.5尺开墒种1行。塘播：播种5—6粒，塘心距1尺，留苗2-3 苗；条播：株距4—5寸，每穴播种2—3粒。 (3)母本：3.6尺开墒种2行，下种6粒，塘心距1尺，留苗2—3苗，(条播：株距4 —5寸)，确保母本株数达6000株以上。

(4)精细播种，力争全苗。若缺塘过多，则全田翻种为宜。 (5)要求育好预备苗。 二、田间管理 1、施肥管理

(1)基肥

重实践,善总结~~~~

2011年杂交水稻制种技术总结

一、关于种植规格

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图一、制种田父母本行比、密度

注：♂表示父本，♀表示母本；父母本行比2:16，父本株距25c

论文题目：浅议杂交玉米高产制种的技术措

施

学者：奥晓林

工作单位：农业委员会

二0一二年五月

目录

杂交玉米高产制种的技术措施

论文关键词：杂交玉米；制种；措施

论文摘要：随着我国农业的飞速发展，玉米单产的不断提高，近

年来，我国杂交玉米种植面积不断上升，玉米杂交种的需求量也随之增加，制种面积不断扩大。我国玉米制种面积不断扩大的同时，因自然灾害、环境条件及技术等造成的种子质量不合格、减产减收甚至绝收现象时有发生，给制种单位和制种农户带来严重经济损失，大量的劣质种子也给农业生产带来严重后果。本文针对这一问题，提出了有效的杂交玉米制种的技术措施。

玉米杂优品种具有高产、抗性强等优点,所以在玉米种植区,种植杂优品种已成为提高产量及增加农民收入的重要途径。为了提高玉米杂交制种产量,探讨玉米杂交制种高产技术,我所进行了三年制种试验。产量由过去的1200kg/hm2提高到现在的2325kg/hm2,增产93.75%。现将高产制种技术介绍如下。

1栽培措施

1.1选地及整地

选隔离条件较好，土壤肥力和光照条件较好，集中连片，有排灌条件，保水保肥力强的地为制种地，并做到精细整地，畦面无大土块，

无杂草，无作物残根，达