抗氧化酶活性测定方法酶标仪

叶绿体的提取

一、试剂配置

1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO（0.0005=0.1g）；4200×使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）; 2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）； 3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；

实际配制：

PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),

悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;

80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）

二、提取步骤

1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10

.

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； （4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100m

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

β-胡萝卜素漂白法测定莲子心粗多糖抗脂质

过氧化的活性 30 mL 试管中加入0. 5 mLβ-胡萝卜素(β2caro2

毛头牛蒡子醇提物抗氧化活性研究

目的", 研究毛头牛蒡子提取物的抗氧化活性。方法",将毛头牛蒡子乙醇提取物采用溶剂萃取法, 分成极性不同的

4 个部分, 并采用DPPH 法和邻苯三酚自氧化法测定各部分的清除DPPH 自由基和超氧阴离子自由基的能力, 以测定其抗氧化活性, 并与抗坏血酸进行比较

DPPH 法抗氧化活性分析", DPPH 自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基, 在517 nm 处有强吸收, 其乙醇水溶液呈很深的蓝紫色, 加入受试物后,517 nm 处可以动态监测DPPH 自由基被清除的效果, 这种效果通常用对DPPH 的清除率来表示。清除率越大, DPPH 自由基清除越彻底, 受试物的抗氧化活性越强[ 6",7] 。计算清除率的公式为:

其中, A0 为未加样DPPH 溶液的原始吸

光度; A为加样后DPPH 液的吸光度; A 样为样品溶液自身的吸光度。公式中引入A0 是为了消除样品溶液本身颜色对实验结果的影响。A 0 的测定: 用移液器取2. 0 mL95% 乙醇, 再取2. 0 mL 已配制好的DPPH