转录组测序技术的发展

转录组分析

研究背景：

RNA-Seq是通过结合实验和计算方法来鉴定生物样品中RNA序列的种类和丰度的一种技术。通过RNA-seq，我们就能够确定单链RNA分子中ATCG的顺序。整个过程主要包括：从细胞或组织中提取RNA分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq技术具有许多早期研究方法（如：微阵列）所不具备的优点，如：RNA-Seq平台的高通量、新技术所带来的高灵敏度、发现新转录本、新基因模型以及非编码RNA的能力等。

RNA-Seq技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而RNA-Seq产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上的巨大差异、鉴定出新的转录本以及能够对small non-coding RNA和lncRNAs有着更好的了解。而且随着测序花费的降低，RNA-Seq的优势体现的更加明显。

服务流程：

样品选取

利用Oligo-dT富集mRNA

mRNA片段化

cDNA合成

末端修复、加polyA、加接头，PCR扩增

数据分析

测序方案：

内容：TotalRNA检测，普通转录组文库构建及测序及信息分析。 测序方式：H

第一章 转录组及转录组测序 第一节 前言

1953年，沃森与克里克对DNA双螺旋结构的精确描绘开创了生命科学的黄金时代，随后如火如荼的开展起来的人类基因组计划建立起庞大复杂的基因组数据库 使人类对了解生命本源和控制生命进程燃起无限憧憬。随着越来越多的基因测序工作渐渐完成，一本“写满生命密码的天书” 呈现在我们面前, 然而，接下来的问题更纷扰而至： 1) 这些基因有什么功能？

2) 不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程？ 3) 基因的表达是如何调控的呢？

4) 基因与基因产物之间是如何相互作用的呢？

5) 相同的基因在不同的细胞内的表达水平有差异吗？

6) 相同的基因处于疾病和治疗状态下的表达水平会有哪些改变？ 如何读懂这本“天书”是目前横亘在科学家们面前严峻的挑战。

因此，在人类基因组项目后，转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学不断涌现，生命科学研究已经跨入后基因组时代。其中，转录组学作为一个率先发展起来的学科是研究细胞表型和功能的一个重要手段，转录组高通量测序技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。

第二节

基于RNA测序技术的转录组从头拼接算法研究

学院： 专业： 班级： 学生姓名： 学号： 指导老师: 完成日期：

I

摘要：生物信息学主要研究分子生物学领域,而对于分子生物学领域，

转录组的从头拼接又是其核心内容,即利用转录组的测序片段拼接出整个转录组中的所有表达的转录体。而RNA测序的出现，在计算上给转录组的拼接提供了一定的挑战。在目前，转录组的拼接算法主要是基于参考基因组的拼接方法与从头拼接方法。虽然基于参考基因组的方法比从头拼接方法更有突破性，不过基于参考基因组的拼接方法，仍然存在着一定的致命缺点，即为要有一个高质量的参考基因组。而从实际情况分析,绝大多数的生物根本不存在一个可供参考的已知基因组,相比之下，头拼接算法的重要性就突显而出。基于该现象，本文主要在分析当前拼接算法的基础上,提出了一个全新的转录组从头拼接算法(Bridger),巧妙地利用基于参考基因组算法的一些技巧来弥补目前从头拼接算法的不足。借助人、狗与老鼠的RNA测序数据上的测试结果,来表明Bridger比当前所有的从头拼接算法突出。除此之外，还将通过例子展示了Bridger在实际应用中重要价值。最后,提出总结，进一步介绍了转录组拼接下游的一些研究工作与研究方向

Trimmomatic使用JAVA运行，支持多线程，数据处理速度非常快，非常适合转录组数据的过滤。由于该软件得到的数据中reads的长度不一，剔除的数据量比较大，不适于基因组的Deno vo数据的过滤。

$ unzip software/Trimmomatic-0.33.zip -d biosoft/ 解压缩安装

$ ls biosoft/Trimmomatic-0.33/adapters/ 查看安装好的文件

可以看到软件的数据库中已经有了接头序列，其中TruSeq3-PE.fa与TruSeq3-SE.fa为illumina hiseq和miseq的接头，如果不是使用hiseq2000的，到illumina官网下载接头序列并放到这个文件夹中。TruSeq2对应着illumina GAII测序

$ cd train/02.sequencing_data_quality_control/ 进入目录

$ mkdir Trimmomatic 新建文件夹

$ cd ~/biosoft/Trimmomatic-0.33/ 进入安装的文件夹

$ java -jar trimmomatic-0.33.jar

调试程序

下面对单端测序转录组数

Trimmomatic使用JAVA运行，支持多线程，数据处理速度非常快，非常适合转录组数据的过滤。由于该软件得到的数据中reads的长度不一，剔除的数据量比较大，不适于基因组的Deno vo数据的过滤。

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$ ls biosoft/Trimmomatic-0.33/adapters/ 查看安装好的文件

可以看到软件的数据库中已经有了接头序列，其中TruSeq3-PE.fa与TruSeq3-SE.fa为illumina hiseq和miseq的接头，如果不是使用hiseq2000的，到illumina官网下载接头序列并放到这个文件夹中。TruSeq2对应着illumina GAII测序

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$ cd ~/biosoft/Trimmomatic-0.33/ 进入安装的文件夹

$ java -jar trimmomatic-0.33.jar

调试程序

下面对单端测序转录组数

北京市理化分析测试中心

第一期转录组学专题研讨班

转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组之间的必然纽带，其研究是基因结构和功能的基础和出发点。通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。为推广转录组研究的基础理论，实验技能和相关的生物信息学分析， 满足临床医技人员、教学科研人员、在读研究生等对高通量技术了解的需求，由北京市理化分析测试中心主办的“第一期转录组学专题研讨班”，将于2015年6月15日至18日在北京开班。本期学习班包括理论讲座与实验操作两部分内容，力求使每位学员在4天时间内都能学有所值、学有所用。

一、培训单位：

主办单位：北京市理化分析测试中心

承办单位：北京百欧美生科技有限公司 华斯泰生物医学科技（北京）有限公司

二、培训日程： 日期 时间 开班仪式 授课内容 讲座1：转录组技术简介 报告人：安云鹤博士 09:00-12:00 6月15日 实验操作1：mRNA分离纯化和逆转录1链合成 1、总RNA样品质检 2、mRNA分离纯化 3、mRNA片段化 4、逆转录-一链合

北京百迈客苎麻根侵染线虫转录组测序分析

Gene552(2014)67–74

ContentslistsavailableatScienceDirect

Gene

journalhomepage:/locate/gene

Genome-widetranscriptional

changesoframie(BoehmerianiveaL.Gaud)inresponsetoroot-lesionnematodeinfection

SiyuanZhu,ShouweiTang ,QingmingTang,ToumingLiu

InstituteofBastFiberCropsandCenterofSouthernEconomicCrops,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410205,China

articleinfoabstract

Ramie berextractedfromstembarkisoneofthemostimportantnatural bers.Theroot-lesionnematode(RLN)Pratylenchuscoffeaeisamajorramiepestandcausesla

分类号

国际十进分类号（UDC）

密级

第四军医大学

学 位 论 文

基于RNA-seq技术的肝细胞肝癌转录组学研究

（题名和副题名）

指导教师姓名

指导教师单位申请学位级别

论文提交日期

论文起止时间

学位授予单位刘寒强 （作者姓名） 陈志南 教授/院士 第四军医大学基础部细胞生物学教研室 博士 专业名称答辩日期细胞生物学 200 年 月至2011 年 月 第四军医大学

独 创 性 声 明

秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我

个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。

申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。

论文作者签名： 日期：

保 护 知 识 产 权 声 明

本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在

校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部

人类基因组计划

一、HGP：人类基因组计划(Human Genome Project) 二、基因组测序 三、基因组分析

四、其他基因组的测序与分析

人的基因这么少，却能行使复杂的功能的原因： 1. 一个基因对应多个产物：可变剪切和蛋白修饰 2. 垃圾基因的功能：非蛋白编码基因的重要功能

任务与进展

完成四张图：遗传图谱、物理图谱、转录图谱、序列图谱

(一) 遗传图谱（Genetic map） 1. 定义

又称连锁图谱（linkage map)或遗传连锁图谱(genetic linkage map) ，是指人类基因组内基因以及专一的多态性DNA标记(marker)相对位置的图谱，其研究经历了从经典的遗传图谱到现代遗传图谱的过程。

2. 经典的遗传图谱（以基因表型为标记） 3. 现代遗传图谱（以DNA为标记）

多态性（polymorphism）：人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation），并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，因而被称为多态性。

? 第一代多态性标记：限制性片段长度多态性-RFLP

? 第二代多态性标记：短的串联重复序列：小卫星DNA、微卫星DNA ? 第

RNA-Seq名词解释

1.index

测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。

2.碱基质量值

（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。

3.Q30

碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。

4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）

每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。计算公式为

公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。

5.FC（Fold Change）

即差异表达倍数。

6.FDR（False Discovery Rate）

即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假