实验一 蛋白质的沉淀与凝固

Ⅱ实验内容

实验一 蛋白质的沉淀与凝固

蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。

促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：

第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。

第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。

一、 蛋白质的盐析

[原理]

高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。

由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。 [操作]

1.取一试管，加入3ml 5%蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。

2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象。（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。） 3.取上项浑浊液1ml，加水2ml，观察是否复容。

二. 乙醇沉淀蛋白质

[原理]

乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。

1

用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀。 [操作]

1. 取试管4支，标出1、2、3、4号码，按下表操作 试剂

5%蛋白质溶液（ml） 1%乙酸（滴） 95%乙醇（ml）

1 1 - -

2 1 1-2 -

3 1 - -

4 - - 2

2.将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中进行），混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混匀，观察各管的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀，比较各管变化并解释之。

三. 重金属盐沉淀蛋白

[原理]

在溶液的PH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）结合成盐而沉淀。 [操作]

取试管4支，按下表操作。 试剂 （滴） 5%蛋白质溶液 1%乙酸 10g/L硫酸铜 30g/L硝酸银

1 5 - 3 -

2 5 - - 3

3 5 10 3 -

4 5 10 - 3

混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。

四. 生物碱试剂沉淀蛋白

[原理]

能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。

在溶液的PH值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。

2

[操作]

取试管3支，按下表操作。 试 剂 5%蛋白质溶液（ml） 1%乙酸（滴） 苦味酸溶液（滴） 鞣酸溶液（滴） 三氯乙酸溶液（滴）

1 1 10 数滴 - -

2 1 10 - 数滴 -

3 1 10 - - 数滴

混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。

五. 蛋白质的加热凝固

[原理]

蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固，在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固现象。 [操作]

取试管4支，按下表操作 试 剂

5%蛋白质溶液（ml） 1%乙酸（滴） 10%乙酸（ml） 100g/LNaOH（ml）

1 2 - - -

2 2 1-2 - -

3 2 - 0.5 -

4 2 - - 0.5

混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。。另外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是否复溶，为什麽？ [试剂]

1．5%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。 2．饱和硫酸铵溶液。 3．硫酸铵结晶粉末。 4．95%乙醇。

5．1%乙酸和10%乙酸。

3

6．30g/L硝酸银溶液。 7．10g/L硫酸铜溶液。 8．100g/L氢氧化钠溶液。

9．苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。 10．100g/L三氯乙酸溶液。

（李素婷）

4

实验三 微量凯氏定氮法

[原理]

蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量。如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白质量。 [操作]

1．取血清或血浆0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀释至10ml（稀释50倍）

2．取消化管1支，加入稀释血清0.5ml，50%硫酸0.5ml, 玻璃珠1枚，在电炉上消化。

3．当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化3分钟左右，冷却，加3%H2O21~2滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏水至17.5ml，再加纳氏试剂至25ml，混匀，与标准管比色。

4．标准管制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm波长比色。

5．标准曲线制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取5支干净试管操作如下

试 剂（ml） 标准硫酸铵应用液 18N H2SO4 蒸馏水

1 - 0.1 3.4

2 0.8 0.1 2.6

3 1.2 0.1 2.2

4 1.6 0.1 1.8

5 2.0 0.1 1.4

混匀，各管加奈氏试剂1.5 ml, 以第1管为空白，用500nm波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线。

6．测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量。 [计算]

蛋白质g %=含氮量?6.25?100 [试剂]

1．50%硫酸

2. 18N硫酸溶液：取比重1.84的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。 3. 3%H2O2 4. 0.9%NaCl 5. 奈氏试剂：

5

奈氏试剂贮存液：于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水100毫升和纯汞150克，振摇到碘色将变时（约15分钟），混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。将上清液倾入2000毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至2000毫升。

奈氏试剂应用液：取10%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液150毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到1000毫升。如浑浊，可静止过夜，取上请液备用。

6．硫酸胺标准贮存液：（1毫升=1毫克氮）

取分析纯硫酸铵置烤箱中110oC，干燥半小时，取出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解，加纯浓硫酸1毫升，再加蒸馏水至刻度。(NH4)2SO4分子量132.06；其氮占28。

故：132.06﹕28=4.716﹕X X=1

即4.716克硫酸铵中含氮1克 7．硫酸铵标准应用液：

取硫酸铵标准贮存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加纯硫酸0.1毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保存。

（周晓慧）

6

实验四 双缩尿法测定蛋白质含量

[原理]

凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。 [操作]

1.标准曲线的制备

取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液

试 剂

标准蛋白溶液（10mg/ml） 生理盐水（ml） 双缩脲试剂(ml) 蛋白浓度(mg/ml)

1 0.0 1.0 4.0 0.0

2 0.1 0.9 4.0 0.2

3 0.3 0.7 4.0 0.6

4 0.5 0.5 4.0 1.0

5 0.7 0.3 4.0 1.4

6 0.9 0.1 4.0 1.8

混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2.样品测定

取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。

[试剂]

1．10g/L标准蛋白溶液：准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理盐水配成浓度为10mg /ml。

2．双缩尿试剂：称取CuSO4?5H2O 2.5g、蒸馏水100ml加热助溶。另取酒石酸钾钠10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200 g/L NaOH 300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至1000 ml。 3.生理盐水

（周晓慧）

7

实验五 改良酚试剂法测定蛋白质含量

[原理]

蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。

利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。 [操作]

（一）制作标准曲线

1．取试管6支分别编号，按下表加入试剂：

试 剂（ml） 标准蛋白溶液（1mg/ml） 生理盐水 试剂A

1 0.0 1.0 0.9

2 0.2 0.8 0.9

3 0.4 0.6 0.9

4 0.6 0.4 0.9

5 0.8 0.2 0.9

6 1.0 0.0 0.9

混匀后置于50?C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，各管加入试剂C 3ml，立即混匀，置37?C水浴箱恒温10分钟。冷却后以1号管为空白，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值。

2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线。 （二）样品测定

取试管2支，按下表加入试剂

试 剂（ml）

稀释的待测样品 生理盐水 试剂A

测定管 1.0 - 0.9

空白管 - 1.0 0.9

混匀后在50?C水浴箱中保温10分钟，取出冷却后，两管各加试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，再各加试剂C 3ml，立即混匀，置37?C水浴箱保温10分钟，冷却后在分光光度计上以波长650nm比色读取光密度值。 [结果与计算]

根据测定管光密度值查标准曲线，由标准曲线计算样品蛋白质含量。 [注意事项]

1.测定蛋白质的浓度应在0.015～0.110mg/ml范围。 2.各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现混浊。

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[试剂]

1.标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。

2．试剂A：2g酒石酸钾钠及100g Na2CO3溶于500ml 1mol/L NaOH中，用蒸馏水稀至1000ml。

3．试剂B：2g酒石酸钾钠及1g CuSO4?5H2O分别溶解于少量水中，混合后加蒸馏水至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。 4．试剂C：

（1）市售的酚试剂，用1mol/L NaOH滴定相当于2.5 mol/L HCl，按1﹕10稀释即可。 （2）称取Na2WO4?2H2O 100g及Na2MoO4?2H2O 25g溶于700ml蒸馏水中，加入85% H3PO4 50ml，浓HCl 100ml混匀后，置圆底烧瓶中回流10小时，加入硫酸锂（Li2SO4?H2O）150g、蒸馏水50ml及浓溴水数滴，继续煮沸15分钟去溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应为金黄色，置棕色瓶中保存，使用时稀释至1mol/L。

（周晓慧）

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实验六 紫外分光光度法测定蛋白质含量

[原理]

蛋白质在280nm处的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质的定量。对于同样浓度的不同蛋白质，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，选用标准蛋白质时必须注意。若样品中含有其它具有紫外吸收的杂质，如核酸、核苷酸等，可产生较大的误差，故应作适当的校正。

蛋白质样品中含有核酸时，混杂的核酸在280nm处也有吸收，对此法有一定的影响。因此，一般情况下在测定A280的同时，测定A260，计算A280/A260 的比值。如果A280/A260≥1.5，可忽略不计核酸的影响，A280/A260<1.5时，需按下列公式计算蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 [操作]

1．标准曲线的制备： 取试管8支按下表加入试剂

试 剂（ml） 标准蛋白液（1mg/ml）

0.9%NaCl溶液 蛋白浓度(mg/ml)

1

2

3

4

5

6

7

8

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 4.000 4.000 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0.000 0.000 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.000

混匀，选波长280nm，用1cm石英比色杯，第一管为空白，分别测定各管溶液光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定：将待测的蛋白样品用0.9%NaCl溶液稀释，使其浓度在蛋白标准曲线范围之内，混匀后按上述方法测定光密度值，查标准曲线，得出样品的蛋白浓度。 [试剂]

1.标准蛋白液：准确称取结晶牛血清白蛋白 （精确0.001）用0.9% NaCl溶液配置成1mg/ml的溶液（需用凯氏定氮法校正）。 2. 0.9% NaCl溶液。

（周晓慧）

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实验七 凝胶过滤层析分离血红蛋白与硫酸铜

[原理]

血红蛋白（分子量64500）与铜溶液混合物，通过葡聚糖凝胶G-25层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，进行分离大分子的血红蛋白和小分子的硫酸铜。

[操作]

1．凝胶的准备：葡聚糖凝胶G-25 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸2小时（或在室温放置6小时），待冷却至室温时装柱。

2．装柱：在层析管底部填少许玻璃棉，关闭玻管的出口。然后自顶部缓缓加入葡聚糖凝胶G-25悬液。

待底部凝胶沉积1～2cm时，打开出口。当凝胶上升至距柱顶3cm时即可。 3．样品的制备：

（1） 血红蛋白的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，3000转/分离心5 分钟，弃去上清液，再用生理盐水洗血细胞两次。将血细胞用5倍体积蒸馏水稀释。

（2） 铜溶液的制备：将硫酸铜3.73g溶解于10ml热蒸馏水中，冷却后稀释到15ml。另取柠檬酸钠17.3g及碳酸钠（Na2CO3·H2O）10g，加水60ml，加热使之溶解，冷却后稀释到85ml。之后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中。

（3）取血红蛋白稀释液、铜溶液按2：3体积混合，作为样品。 4．加样：

（1）将层析柱出口打开，使床表面的蒸馏水流出，直到床面正好露出，再关闭出口。

（2）用小滴管将样品（约0.8ml）沿柱内壁缓缓地加于床面上，然后打开流出口，使样品进入床内，直到床面重新露出。

（3）用上述方法加入约2ml蒸馏水。当将近流干时，反复加入多量蒸馏水，进行洗脱，直至红蓝两条带分开为止。

[试剂]

1．葡聚糖凝胶G-25。 2．草酸钾。 3．生理盐水。 4．硫酸铜。 5．柠檬酸钠。

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6．碳酸钠。

（王鲁华）

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实验八 凝胶过滤层析分离血红蛋白与鱼精蛋白

[原理]

本试验使用交联葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）将血红蛋白（红色，分子量为64500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白，从混合液中分开。由于它们的分子量及颜色的不同，可以观察到血红蛋白洗脱较快，而鱼精蛋白洗脱较慢。

[操作] 1．凝胶的制备

称取Sephadex G-50 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸1小时（此为加热法溶胀，如在室温溶胀，需浸泡3小时），取出冷却至室温后再行装柱。

2．装柱

取直径0.8～1.5cm，长度17～20cm的层析管，在底部填砂芯或少许玻璃棉，装上带有螺旋夹和细玻管的橡皮管，垂直置于铁架上，柱中先加入少量水，充满细玻璃管，并残留部分水于层析管下部，以排除层析柱底部及细玻管内的气泡。然后关闭玻管的出口，边轻轻搅拌以蒸馏水稀释的葡聚糖凝胶悬浮液，边将其自层析管顶部缓缓加入，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，一面继续加凝胶，待凝胶上升至距玻管顶3cm左右即可停止，最后以蒸馏水平衡凝胶柱。加入凝胶时速度应均匀，并使凝胶均匀下沉，以免层析床分层，同时防止柱内有气泡。如层析床凝胶表面不平整，可在凝胶表面用细玻棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使表面平整。

3．样品的制备

（1）血红蛋白（Hb）溶液的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，以2500r/min离心5分钟，弃去上层血浆，用0.9％NaCl 5ml洗血细胞，重复三次，每次要把血球搅起，以3500r/min离心5分钟后尽量弃去上清液。加蒸馏水5ml，充分混匀，放冰箱过夜使沉淀的血球充分溶血，备用。

（2）DNP-鱼精蛋白的制备：称取鱼精蛋白0.15g，溶于10％NaHCO3溶液1.5ml中（此时该蛋白质溶液pH应在8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95％乙醇3ml中，待其充分溶解后，立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中，煮沸5分钟，冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。离心5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸馏水溶解，即为DNP-鱼精蛋白溶液，备用。

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（3）取血红蛋白稀释液0.1ml，加DNP-鱼精蛋白溶液0.2ml，充分混匀，此混合液即为样品溶液。

4．加样

加样时先将层析管出口打开，使床表面蒸馏水流出，直到床面正好露出，用下口较大的滴管，将上述样品（约0.3ml）缓缓沿层析柱内壁小心地加于床表面，注意尽量不使床面搅动，然后打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出，重复上法加1～2倍于样品体积的蒸馏水，这样可使样品的稀释最小，而样品又完全进入床内。当少量蒸馏水将近流干时，加入蒸馏水使其充满层析柱上面空间，开始洗脱。

5．洗脱与收集

反复加入蒸馏水洗脱，调节出口处螺旋夹，使洗脱速度在0.5～1.0ml／分左右（约10～15滴／分）洗脱时可观察到黄、红两条区带逐渐分开，当红色的血红蛋白区带到达玻管下端时，用带刻度的离心管收集流出液，直至红色液全部流出为止，待测。再换以另一离心管，收集黄色的DNP-鱼精蛋白洗脱液，直至黄色液全部洗出为止，此液可回收重新使用。

[结果与计算]

取一试管吸取前述血红蛋白液0.1ml，加蒸馏水至5ml作为标准管（上柱前液），取收集的血红蛋白液加蒸馏水至5ml。以蒸馏水为对照，测得标准管及收集管液体在540nm波长处的光密度值，按下列公式计算血红蛋白的回收率。

血红蛋白回收率（％）＝洗脱收集液光密度值／上柱前液光密度值 ×100％ [试剂]

1．Sephadex G-50 2．草酸钾抗凝血液 3．0.9％NaCl 4．鱼精蛋白 5．10％NaHCO3 6．2，4-二硝基氟苯 7．95％乙醇

（王鲁华）

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实验九 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

[原理]

血浆中的各种蛋白质，它们的等电点都在pH7.0以下，如将它们置于pH8.6的缓冲液中电泳时，它们都解离成负离子，向正极移动。在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的数量不同以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，利用这种性质可以把各种蛋白质分开。

醋酸纤维薄膜作为电泳支持物具有电渗小、分离速度快，区带清晰、操作简便等优点。醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分为白蛋白及α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白γ-球蛋白等5条区带。固定染色之后，不仅可看到清晰的色带，并可将各带染料溶于碱溶液中进行定量测定，从而计算出血清中各种蛋白质的构成比。 [操作] 1．准备与点样：

（1）将薄膜切成2×8cm的小条，在薄膜无光泽面距—端1.5cm处用铅笔画一横线，表示点样位置。

（2）将薄膜无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液中(缓冲液盛于培养皿中)。 （3）将充分渗透(指膜上没有白色斑痕)的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上使点样线驾空。

(4)吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加样器的钢口蘸取样品，平直印于膜上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。

2．电泳：将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极。槽架上四层纱布怍桥垫，膜条与纱布需贴紧，待平衡5分钟后通电，调节电压至90V，或电流为0.4～0.6mA/cm宽，通电1小时左右关闭电源。

3．染色：通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，首先用自来水冲洗一下，然后立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景变白为止。用滤纸吸干薄膜。 4．定量：

（1）取试管6支，编好号码，分别加入0.4mol/L氢氧化钠4ml。

（2）剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪—平均六小的薄牵，分别浸入上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。

（3）约半小时后，用分光光度计进行比色，在650nm波长下读取各管的光密度，用空白薄膜条洗出液为空白对照。

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上清液。

8．拜耳（Bial）氏试剂 称取1.5g3，5-二羟甲苯，加入浓盐酸500ml，再加10%氯化高铁20至30滴。临用前配制，冰箱保存。

9．二苯胺试剂 取二苯胺1g溶于100ml冰乙酸（A.R.），加入2.75ml浓硫酸。临用前配制，储于棕色瓶中。

（王鲁华）

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实验十三 动物组织中DNA的提取

[原理]

动物组织中的基因DNA均以脱氧核糖核蛋白的形式存在。在浓氯化钠（1～2mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，而核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠（0.14mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，而核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS处理，使DNA与蛋白质分开，再用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于上层水相中，加入适量的95%乙醇，DNA钠盐即沉淀析出。为防止DNA酶解，提取时应加入EDTA二钠（乙二胺四乙酸）。

得到的样品中DNA含量可用二苯胺法定量测定。DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中转变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，可用比色法测定。

[操作]

1.DNA的分离纯化：

（1）将10只小白鼠迅速杀死，取出肝脏，用0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液洗去血液，剪碎，加入50ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液，置于匀浆器中研磨，待成糊状后，将糊状物离心10分钟（4000r/min）弃去上清液，沉淀用0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液洗二三次。即重复加入50ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液，搅匀，离心。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。

（2）向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液，使总体积为44ml，然后滴加25% SDS溶液3ml，边加边搅拌。加毕，置60C水浴中保温10分钟（不停搅拌），溶液变得粘稠并且略透明，取出冷至室温。此步骤使核酸与蛋白质分离。 （3）加入5mol/L NaCl溶液10ml，使NaCl最终浓度为1mol/L，搅拌10分钟，加入约一倍体积氯仿-异丙醇混合液，振摇20分钟，离心10分钟（4000r/min）。沉淀与下层液弃去，取上层液加入1.5倍体积95%乙醇，边加边用玻棒搅拌，DNA丝状物即

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缠在玻棒上。

（4）将DNA粗品置于27ml 0.015mol/L NaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml 1.5mol/L NaCl-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液，搅匀。待丝状DNA重新溶解后，加入一倍体积氯仿-异丙醇混合液，振摇10分钟，离心（4000r/min）10分钟。可用氯仿-异丙醇反复抽提，直至界面处不再出现蛋白质凝胶为止。取出上层液加入1.5倍体积的95%乙醇，边加边搅拌，DNA丝状物即缠在玻棒上。

（5）取出丝状DNA，依次用80%、95%及无水乙醇各洗一次，真空干燥。留待定量测定。

2．鉴定

（1）标准曲线的绘制：

取干试管6支，编号，按下表加入试剂： 试 剂（ml） DNA标准液（50μg/ml） 0.5mol/L过氯酸 二苯胺试剂

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0 0 1.0 2.0

1 0.2 0.8 2.0

2 0.4 0.6 2.0

3 0.6 0.4 2.0

4 0.8 0.2 2.0

5 1.0 0.0 2.0

混匀，60C恒温水浴中放置1小时。冷却后，于600nm波长处进行比色。以各管光密度为纵坐标，DNA含量为横坐标作图。

（2）样液测定：称取干燥的样品DNA 5mg溶于5ml 5mmol/L NaCl 溶液中，再按标准DNA溶液同法处理。然后，取1.0ml样液，加二苯胺试剂2.0ml，置60C恒温水浴1小时，测定光密度。对照标准曲线求得DNA量。

[结果与计算]

按下式计算样品中DNA的百分含量：

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[注意事项]

1．本实验也可用新鲜兔肝10g进行DNA的提取，本法提取的DNA已有一定程度的解聚。

2．其它糖及糖的衍生物、芳香醛、羟基醛和蛋白质等，对二苯胺显色反应有干扰，

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测定前应尽量除去。

3．样液中DNA含量应控制在50μg/ml左右。 4．如无匀浆器，可用研钵研磨破碎组织。 [试剂]

1．5 mol/L NaCl溶液：将29.23g NaCl溶于蒸馏水，稀释至100ml。

2． 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA二钠溶液：溶8.18g NaCl及55.83g EDTA二钠于蒸馏水，稀释至1000ml。

3．25% SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于100ml 45% 乙醇。 4．氯仿-异丙醇混合液：氯仿：异丙醇=24﹕1（V/V）

5．1.5mol/L NaCl-0.15mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠8.77g及柠檬酸三钠4.41g溶于蒸馏水，稀释至100ml。

6．0.015mol/L NaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液：取10ml试剂5，稀释至1000ml。 7．80%乙醇。 8．95%乙醇。 9．无水乙醇。 10．二苯胺试剂：

A液：二苯胺（如不纯，需在10%乙醇中重结晶2次）1.5g，溶于100ml冰乙酸（A．R．），再加浓硫酸1.5ml，贮于棕色瓶。

B液：16mg乙醛溶于1.0ml蒸馏水，随用随配。 临用时，将20ml A液与0.1ml B液混合即得。

11．1mol/L过氯酸溶液：将10ml 过氯酸（70%）用蒸馏水稀释至110ml。 12．0.5mol/L过氯酸溶液：取50ml 1mol/L过氯酸，用蒸馏水稀释至100ml。 13．5mmol/L NaOH溶液：NaOH 0.02g溶于蒸馏水，稀释至100ml。

14．标准DNA母液：准确称取DNA5mg，溶于5ml 5mmol/L NaOH溶液中。4C可保存6个月。

15．标准DNA溶液：吸取母液1.0ml加上1mol/L过氯酸1.0ml，70C保温10分钟，冷却，离心（4000r/min），取1.0ml上清液，用0.5mol/L过氯酸稀释10倍，即得50μg/ml DNA标准溶液。

（王鲁华）

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实验十四 动物组织中核酸含量的测定

核酸分子中含有戊糖、磷酸和含氮碱。一般测定核酸的方法，是测定三者中的任何一种成分即可计算核酸的含量。下面分别介绍测磷法、测糖法和紫外吸收法。 一、测磷法 [原理]

核酸的量可以用核酸的磷含量（RNA-P，DNA-P）来表示。纯的核酸含磷量为9%（RNA的磷含量为8.5～9.0%；DNA的磷含量为9.2%）。测得了核酸中磷的含量，即可求出核酸的含量。

用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，再被还原剂还原成钼蓝，用比色测定。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，以此为定量依据。 样品中如有无机磷，应减去。

[操作]

1．磷标准曲线的绘制：取试管7支，按下表操作。 试剂（ml） 磷标准溶液（5μg/ml） 蒸馏水 定磷试剂 磷含量（μg）

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1 0 3 3 0

2 0.5 2.5 3 2.5

3 1.0 2.0 3 5.0

4 1.5 1.5 3 7.5

5 2.0 1.0 3 10

6 2.5 0.5 3 12.5

7 3.0 0 3 15

混匀，于45C水浴中保温20分钟，冷却，在660nm波长下测定各管光密度。以磷含量为横坐标，光密度为纵坐标绘制出磷标准曲线。

2．核酸中总磷量的测定：取1ml被测样品液（约含2.5～5mg核酸，也可取固体样品）置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色或淡蓝色为止，稍冷却，加1ml水，于100C加热10分钟，使焦磷酸转变为磷酸。冷至室温，用蒸馏水定容到50ml。与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其它完全相同。

取稀释后的消化液1ml，加水2ml，定磷试剂3ml，摇匀，45C放置20分钟，于660nm

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