免疫共沉淀

免疫共沉淀 from WHU SKY

1用细胞刮子收细胞，3000rpm，5min，离心，去上清；或者弃培养基后直接用裂解液裂解细胞。从细胞裂解开始要保持低温，冰上或4度冰箱或4度离心机。

2 PBS清洗，重复步骤1

3选择合适的bufer裂解细胞，现加1000XAL（一般核质均分布的建议使用NP-40，核内分布的建议使用High Salt ，只要求拉下抗原的建议使用RIPA buffer），加入1ml Buffer (106-107个细胞)，4℃,30min（在功能旋转仪上旋转裂解）。 4 12000rpm，15min，离心取上清（若上清仍浑浊，可重复离心1-2次）50ul上清作为 Input，其它各取400ul分别加入特异性抗体和对照IgG均1ug（可根据抗体效价酌情增减），4℃,旋转2-4h，

加抗体时要计算使用相同抗体的样品数，取（N+1~2）*1ug，用小量裂解buffer

稀释，再均分到各样品中，以保证抗体加入量的一致。 5细胞裂解液和抗体孵育期间，准备Protein G（一个反应20ul纯beads，如果beads原管中液体和beads体积比是1:1，一个样品取总体积40ul，多个样品需要多取1-2个样品的beads/液体混合物），用PBS清洗两次（3000rpm，1min）。

每次离心完毕最好静置几分钟，待beads完全从液体中沉降下来再小心弃上清。此处不必要把液体吸得特别干。估算beads体积，加入同样体积的裂解buffer。

6 （接4）将抗体和细胞裂解液混合物再次离心（12000rpm，15min），转移到新的EP管中，每个样品吸取同等体积上清，加入洗好的与裂解液1:1混合Protein G（40ul/sample），4℃,旋转1h。

取beads时要从50ull刻度处剪断黄枪头，每次都需充分混匀beads后再取样，以保持加入量一致。

7 用裂解buffer清洗beads 3-5次，最后一次用真空泵抽干，加入20-50ul 2×SDS Loading ，95℃煮样5min。样品冻至-20 ℃

每次离心完毕最好静置几分钟，待beads完全从液体中沉降下来再小心吸弃上清。前面几次不必要把液体吸得特别干，可以保留一点液体以免beads被吸走。最后一次要求吸干些，可用微量移液器将小体积液体吸干，但是要及时清洗，以免堵塞微量移液器。小心操作不要损失beads。

备注：用IgG做对照的实验设置是比较传统的，在内源性相互作用中常用。另一种设置是

例如检测F-A和HA-B的相互作用

转染设置 A B A+B IP：仅用a-F 或者a-HA

如果有knockout细胞就可以做内源性IP的最好对照，而不用再做IgG对照。

注意事项：

1内源或外源免疫共沉淀操作基本一致，只是内源一般要求细胞较多，所以容易出现背景，解决方法如下：

增加离心的次数； 加入抗体后旋转过夜；

针对核内的相互作用，可考虑先分离胞质胞核，用核提取物检测； 用滤网过滤上清

2相互作用较弱的两个蛋白可考虑先交联，再裂解，具体操作如下：

（1）10cm dish（10ml培养基中）加入300ul 37%甲醛轻摇混匀（终浓度是1%），

室温固定10min （2）加入500ul 2.5M Glycine 终止固定 5min，弃掉培养基 （3）收细胞，PBS清洗2次（3000rpm，5min）

（4）弃上清，加入500ul RIPA buffer，4℃超声波破碎（30%，1min） （5）12000 rpm离心15min ，取上清加入抗体，下面操作同上。

NP-40 Lysis Buffer

50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 0.5% NP-40

临用前加入1mM DTT，1×AL High Salt Lysis Buffer 20mM Hepes, pH7.4, 10% glycerol, 0.35M NaCl, 1mM MgCl2,

0.5% Triton X-100,

临用前加入1mM DTT，1×AL RIPA buffer

50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 0.1% SDS 0.5% NP40

0.5% Na.Deoxycholate 临用前加入1×AL

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