SSR 分子标记技术在玉米育种中的应用

SSR 分子标记技术在玉米育种中的应用

SSR分子标记技术在玉米育种中的应用

王勇,张元昶,方忠 (广西大学农学院,广西南宁530005)

摘要 介绍了SSR分子标记技术的原理、特点、类型及其在玉米遗传图谱的构建、品种纯度鉴定和玉米遗传多样性等育种中的应用。关键词 玉米;SSR;遗传育种

中图分类号 S513.032 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)01-00052-03

UtilizationofSSRMarkersinMaizeGeneticBreedingWANGYongetal (AgriculturalCollege,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi530005)Abstract Theprinciple,characteristicsandtypesofSSRmarkerswereintroduced.Inaddition,itsapplicationwasmainlyreviewedinthreeaspectsin-cludingtheconstructionofthegeneticlinkagemap,thedetectionofthepurityofvarietyandthestudyofthemaizegeneticdiversity.Keywords Maize;SSR;Geneticbreeding

玉米是重要的粮食与饲料作物,是世界三大作物之一。但是由于对玉米中许多性状的遗传机制缺乏了解,从而限制了玉米产量的提高与品质的改善,阻碍了玉米育种工作的进程。建立在分子遗传学基础上的分子标记技术的迅速发展,促进了作物育种研究各个领域的发展。分子标记能在DNA水平上反映植物遗传基础的差异,是植物遗传育种领域内的一项新兴技术。SSR(SimpleSequenceRepeat,简单重复序列)就是当今四大分子标记技术之一。1989年3个独立的研究小组几乎同时建立了该技术,并且证实它作为位点特异遗传标记具有巨大潜力。SSR技术的特点是呈共显性遗传;在数量方面没有生物学上的限制;其标记带型简单,记录的条带一致、客观、明确;采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品,且质量要求不高,即使是部分降解的样品也可进行分析;每个位点均有许多等位形式;另外,它还具有多态性高、实验程序简单等优点[1]。1 SSR分子标记技术简介

1.1 原理和特点 SSR又称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)、短串联重复(Tendom-repeats)或简单序列长度多态性(Simplesequencelengthporlymorphism),通常是指以2～4个核甘酸为单位多次串联重复的DNA序列,也有少数以1～6个核甘酸为串联重复单位。SSR标记具有多态性高的特点,需要的DNA的量很少,比较适合育种工作。SSR在基因组中的分布是随机的,它可以存在于内含子、外显子及染色体的其他任何区域。在不同植物中,SSR重复单位的碱基组成及拷贝数随物种的不同而有所差异,但SSR两端的序列是保守的。因此,可以设计出与SSR两端保守序列互补的引物,通过PCR扩增重复序列和凝胶电泳检测其多态性。SSR序列多态性的出现是由于同一物种中不同基因型的寡聚核苷酸重复次数不同以及重复序列在染色体复制时的滑动或染色单体的不等交换造成的,因此SSR可用作分子标记。由于玉米中存在转座子,微卫星的多态性表现得极为丰富,所以SSR技术较其他分子标记技术更适合于玉米研究[2]。

1.2 类型 根据SSR核心序列排列方式,可将SSR分为完全型(Perfect)、不完全型(Imperfect)和复合型(Compound)[3]。完全型SSR是指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构

作者简介 王勇(1964-),男,广西南宁人,农艺师,从事玉米遗传育种

方面的研究。

收稿日期 2006-07-18

成的DNA;不完全型SSR是指在SSR的核心序列之间有3个以下的非重复碱基,但两端的连续重复核心序列重复数大于3;复合型SSR是指2个或2个以上的串联核心序列由3个或3个以上的连续的非重复碱基分隔开,但这种连续性的核心序列重复数不少于5。3种类型内完全型是SSR标记中应用较多的一种类型[4]。

根据SSR核心序列碱基数目,可将SSR分为单碱基重复型、2碱基重复型、3碱基重复型、4碱基重复型等。各种SSR在植物基因组中的丰度(频率)不同。WANG对EMBL和GenBank中的54个植物种的核DNA(3026kb)和28个植物种的细胞器DNA(1268kb)进行了各类SSR(1～4bp)的搜索,发现(AT)n是植物基因组中最丰富的SSR,然后依次为(A)n (T)n、(AG)n (CT)n、(AAT)n (ATT)n、(AAC)n (GTT)n、(AGC)n (GCT)n、(AAG)n (CTT)n、(AATT)n (TTAA)n、(AAAT)n (ATTT)n以及(AC)n (GT)n[5]。同一类型内核心序列碱基种类不同的SSR的丰度也差别很大。MORGANTE和OLIVER2I从GenBank和EMBL查询了植物SSR序列,发现在2碱基重复型SSR中(n>10),各种SSR相对频率是(AT)n74%、(AG)n24%、(AC)n1%、(CG)n0;在3碱基重复型(n>7)SSR中,各种SSR相对频率是(TAT)n27%、(TCT)n25%、(CAG)n12.5%、(TGT)n10%、(ATC)n7.5%,其他均小于5%。1.3 在玉米基因组中的分布 研究SSR在植物基因组中分布的方法有2种:①对基因数据库中已有的DNA序列进行分析;②用SSR作探针与大片段基因文库进行杂交。尽管不同作者所用方法不同,但是所得结果大致相同。玉米中SSR的主要重复单位及其拷贝数分别是GA3.1×103和AC1.9×103。通过EMBL检索到玉米的DNA长度是410.5kb,SSR的数目是7,估计总数目为4.3×103[7]。李新海等利用69对SSR引物筛选出43对扩增产物具有稳定性和多态性的引物,研究了21个玉米自交系的遗传变异,共检测出127个等位基因变异,每对引物检测等位基因2～7个,平均2.95个,多态性信息量平均为0.511[8]。

2 SSR分子标记技术在玉米育种中的应用

2.1 玉米遗传图谱的构建及基因定位 构建玉米遗传图谱及寻找与目标性状紧密连锁的分子标记是进行分子辅助选择育种的基础。而玉米最初的遗传图谱是以RFLP标记为主的连锁图。与RFLP相比,SSR检测的多态性要高很多,对于构建高密度的遗传图谱有用,也能更好地应用于玉米育种中。以

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SSR为主的遗传图谱构建的基本原理是以SSR位点为基础,在基因组中每隔一定距离找一个多态性的SSR标记,当这些标记达到足够的饱和度后则可利用SSR标记找到基因组中的任何功能基因和数量性状位点(Quantitativetraitloci,QTL),并进行连锁分析,确定该功能基因和QTLs的位置。

近年来利用SSR标记在玉米主要经济性状、抗性性状的遗传图谱构建及基因定位方面取得了显著成果。向道权等以中国农业大学培育的高产、多抗性玉米杂交组合农大3138的F2∶3家系为材料,构建了具有80对SSR标记的玉米遗传图谱,标记间平均距离25.42,覆盖了玉米基因组的2033.4cm,并检测到了同玉米产量有关的8个性状的农大108的纯度鉴定为例,探索了SSR技术在玉米杂交种鉴定中实际应用的可行性,建立了适用于玉米品种鉴定的SSR标准体系[19]。赵久然等利用玉米果皮中提取的DNA进行SSR分析,发现玉米F1代种子具有与杂交种母本完全相同的DNA指纹,可用于种子的真实性鉴定[20]。高文伟等利用SSR标记技术分别筛选出玉米杂交种农大108和豫玉27的特异性引物,有效地鉴定两个杂交种的种子纯度[21]。李群等以登海11号玉米杂交种及其亲本和9对玉米SSR位点引物为材料,筛选出了适合该杂交种纯度鉴定的SSR位点引物[22]。李汝玉等在对玉米籽粒DNA提取和SSR扩增片段检测方法等研究的基础上,建立了一套利用SSR标记进行玉米杂交QTLs[9]。汤继华等用SSR标记将A619C型不育恢复基因定位在第8染色体短臂上,与SSR引物bnlg2301连锁,并确定该基因为Rf4[10]。王凤格等构建了具有65个SSR位点的遗传图谱,覆盖玉米基因组1333.3cm,标记间平均距离20.5cm,并对抗甘蔗花叶病毒的数量性状位点进行定位及遗传效应分析[11]。刘章雄等以玉米南方型锈病免疫自交系P25与感病自交系F349的杂交组合的F2∶3家系为构图群体,构建了玉米SSR遗传连锁图,将玉米抗南方型锈病基因定位于10号染色体上,与Phi059标记连锁[12]。赵茂俊等以玉米自交系R15(抗纹枯病)×478(感纹枯病)F2分离群体为作图群体,构建包含146个SSR标记位点的遗传连锁图谱,覆盖玉米基因组1666cm,平均图距11.4cm,结果共检测到6个抗性QTL,分别位于第2、6、10染色体上[13]。Song等用439对SSR引物对2个亲本By804(BHO群体)和B73进行多态性检测,在F2和F3群体中获得153个共显性标记位点,构建了包含151个SSR标记位点高油玉米分子标记连锁图,图谱总长度为1759.1cm,相邻两标记间的平均距离为11.65cm,而且在F2群体中定位了27个影响玉米籽粒油分含量的QTL[14]。由此可见,随着分子技术的发展,以SSR为主的遗传图谱的构建会更加完善,可应用SSR标记将更多的基因定位到玉米基因的染色体上。

2.2 玉米杂交种的纯度鉴定 玉米杂交种纯度和亲本遗传的真实性是玉米种子质量的重要标志之一。目前我国95%玉米生产都采用杂交种,因此建立一套简便、快速、准确的玉米种子质量检测方法对于规范种子产业,保护广大农民的切身利益,促进农业增产、农民增收,保障国家粮食安全具有重要意义。同一物种的不同品种具有区别于其他品种的独特SSR标记,这些特异性标记的组合就构成了这一品种的指纹图谱。因此,通过检测品种的指纹片段可以有效鉴定品种的纯度和真伪。

Smith研究表明,绝大多数玉米杂交种SSR位点等位基因呈共显性[15]。李汝玉等提出可利用SSR位点上等位基因间大小的差异和共显性遗传特点鉴定玉米等作物杂交种的纯度[16]。李小辉等以21份玉米骨干自交系及其组配的13个杂交种为材料进行SSR标记分析,发现应用SSR标记技术可快速、准确地鉴定玉米杂交种种子纯度[17]。吴渝生等以3个云南省大面积推广的玉米杂交种及其亲本为试材,从96对SSR引物中筛选出24对多态性丰富的引物,建立了标准SSR标记指纹图谱[18]。王凤格等以玉米杂交种

种纯度鉴定的技术规程[23]。由此可见,SSR标记技术可以作为真实性鉴定、纯度检测以及新品种保护的仲裁技术依据之一。2.3 玉米自交系遗传多样性分析及杂种优势群划分 亲本的遗传多样性分析是杂种优势研究的一个重要组成部分。国内外学者采用了多种方法对玉米遗传多样性进行了研究,其中SSR标记因其具有高度多态性而成为遗传差异研究的主要工具。

袁力行等利用RFLP、SSR、AFLP和RAPD4种分子标记方法研究了15个玉米自交系的遗传多样性,发现SSR标记位点的平均多态性信息量(PIC)最大,并且认为AFLP和SSR是研究遗传多样性的最好标记[24]。番兴明等研究了代表我国温带玉米主要杂种优势群的4个标准测验种、5个热带玉米群体及Autigua种族的25个典型自交系,根据产量配合力并结合SSR分子标记将供试自交系划分为四个类群[25]。李新海等利用SSR标记研究了70份我国主要玉米自交系的遗传变异[26]。李玉玲等利用113对多态性SSR引物研究了来源于8个基础材料的26个爆裂玉米自交系的遗传多样性及其与分属6个杂种优势类群的20个普通玉米骨干自交系的种质关系[27]。聚类结果将46个供试自交系分为爆裂和普通玉米自交系2个大类;26个爆裂玉米自交系分为8个类群,高杂种优势组合的双亲自交系均属于不同类群,而在同一类群自交系间尚未组配出具有高杂种优势的组合;普通玉米自交系的分类结果与以往研究和育种实践相一致,表明SSR标记技术可以用于爆裂玉米自交系间的遗传多样性研究。吴渝生等利用SSR标记技术,通过聚类分析将云南糯玉米分为3个类群和5个亚群,云南爆裂玉米分为3个类群和4个亚群[28]。这2种类型的玉米聚类结果与云南不同海拔地势的变化走向基本相符。王铁固等以6个玉米群体为材料,利用SSR标记分析其遗传多样性并进行聚类分析,表明在6个玉米群体中检测到了丰富的遗传变异,依据SSR标记的遗传距离将供试材料分为四大类[29]。刘希慧等利用SSR分子标记技术对当前和过去广泛应用的12个玉米自交系进行遗传多样性分析,并划分了杂种优势群,表明用SSR标记划分杂种优势群与自交系系谱关系基本一致[30]。刘世建等利用SSR标记技术研究了四川地方玉米种质和辽宁省主要玉米自交系遗传多样性,表明分类结果与系谱来源基本一致[31-32]

。生产上杂交种

的亲本大多来自不同的类群。由此可以得出,SSR标记可用于玉米自交系遗传多样性分析,并且精确地划分杂种优

SSR 分子标记技术在玉米育种中的应用

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SSR标记技术以其丰富的多态性、共显性遗传、重复性好和操作简单等优点成功地应用于玉米遗传图谱的构建、品种纯度鉴定和玉米遗传多样性等方面的研究中。但是,在遗传图谱的构建中,SSR技术只能对重复序列区域进行染色体定位,因此若要构建高密度的遗传图谱则必须结合其他分子标记技术以增加相邻重复序列之间的遗传标记数目。此外,SSR标记分析中还存在一些问题。例如,开发和合成新的SSR引物投入高、难度大。所以,要加大研究力度,使SSR标记在玉米遗传育种中得到更为广泛的应用。参考文献

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