抗黄瓜花叶病毒RNAi载体的构建及烟草的转化

ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１１（５）：６９－７２Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ２０１０，ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨＡＡＳ．Ａｌｌｒｉｇｈｔｓｒｅｓｅｒｖｅｄ．

ＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉＶｅｃｔｏｒＷｈｉｃｈＲｅｓｉｓｔＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｏｂａｃｃｏ

ＺＨＡＮＧＹｕ，ＺＨＥＮＧＹｉｎｙｉｎｇ，ＺＨＡＯＦｅｎｇｙｕ，ＱＩＡＯＹａｈｏｎｇ，ＣＵＩＢａｉｍｉｎｇ，ＸＩＡＮＧＢｅｎｃｈｕｎ

ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｒｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００３

Ａｂｓｔｒａｃｔ　［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＡｉｍｅｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｈｉｓｖｅｃｔｏｒｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏ．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＲＴＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＮＳ０４ａｎｄｐｒｏｃｅｓｓＲＮＡ２ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｏｆｔｏｍａｔｏｉｓｏｌａｔｅｓ．ＴｈｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＲＮＡ２ｅｎｃｏｄｅｄＣＭＶ２ａｈａｄ９８．０％ａｎｄ９６．５％ｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｏｆ

，Ｃｈｉｎａ．ＴｈｅｒｅｐｌｉｃａｓｅｆｒａｇｍｅｎｔｉｎＣＭＶＲＡＮ２ｇｅｎｅｗａｓｔａｋｅｎａｓｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｕｋａｒｙＤＱ４１２７３１ｉｓｏｌａｔｅｏｆＺｈｅｊｉａｎｇ

ｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｔｈｒｏｕｇｈａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏｔａｂａｃｃｏａｎｄＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｃｈｅｃｋｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒ．ＴｈｅＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｈａｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｐＢｉ３５ＳＣＲ２ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏｔａｂａｃｃｏ．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓｃｈａｌｌｅｎｇｅｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｉｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｏｍａｔｏｒｅｓｉｓｔｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ；Ｈｏｍｏｌｏｇｙ；ＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒ；Ｔｏｂａｃｃｏ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ

Ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｔｏｃａｕｓｅｙｉｅｌｄｒｅｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｖｅｎｎｏｈａｒｖｅｓｔｏｆａｖａｒｉｅｔｙｏｆｅｃｏｎｏｍｉｃｃｒｏｐｓ，ｂｕｔｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｎｔｉｖｉｒｕｓｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｔｉｓｓｕｅｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｅｓｔｉｃｉｄｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｃａｕｓｅｅｎｖｉ

［１］

ｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，ａｎｄｔｉｍｅｃｏｎｓｕｍｉｎｇ．Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｏｆｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｓａｃｏｍｍｏｎｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｅｘｉｓｔｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｉｆｅ，ｗｈｉｃｈｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｗａｙｏｆｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＴｈｅｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆＧＭｓｐｅｃｉｆｉｃｃａｎｂｅｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｂｙｇｒａｆｔｉｎｇｆｒｏｍｓｉｌｅｎｔｓｔｏｃｋｔｏｎｏｎｓｉｌｅｎｔｓｃｉｏｎ，ｔｈｅｎｔｈｅｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｏｆｔｈｉｓｋｉｎｄｏｆｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｉｇｎａｌｆｒｏｍｏｎｅｃｅｌｌｏｒａｔｉｓｓｕｅｔｏａｎｏｔｈｅｒｃｅｌｌｏｒｔｉｓｓｕｅｉｓｄｅｆｉｎｅｄａｓｓｙｓｔｅｍｉｃ

［２－５］

ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）．ＲＮＡｉｈａｓｓｏｍｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｗｈｉｃｈａｒｅｄｅｆｉｃｉｅｎｔｉｎｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｔｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ，ｉｔｈａｓｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｗａｙｔｏｓｔｕｄｙｐｌａｎｔｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｅｌｅｔａｎｔｃａｎｂｅｃｒｅａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｈａｂｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｅｘ

［６］

ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｅｆｆｉ

，ＲＮＡｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓａｃｉｅｎｔａｎｄｓｙｓｔｅｍａｔｉｃＲＮＡｉｓｅｑｕｅｎｃｅ

，ｉｔｈａｓｂｅｅｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｉｔｓｕｎｉｑｕｅｒｏｌｅｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｓｐｅｃｉａｌｒｏｌｅ

ｉｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｖｉｒｕｓｅｓ，ｗｏｒｍｓａｎｄｈａｒｍｆｕｌ

［７－８］

ｐａｒａｓｉｔｅｓ，ａｓｗｅｌｌａｓｇｒａｆｔｉｎｇｂｒｅｅｄｉｎｇ．

Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｎＣＭＶａｒｅｆｏｃｕｓｅｄｏｎｒｅｐｌｉｃａｓｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙＲＮＡ１ｇｅｎｏｍｅｏｒＣＰｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙＲＮＡ３ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｅｃｌｏｎｅｄＣＭＶＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅ２ａｒｅｐｌｉｃａｓｅｐｒｏｔｅｉｎｗｈｉｃｈｗａｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｓｉｇｎＲＮＡｉａｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｔｏｂａｃｃｏｔｈｒｏｕｇｈＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄ

，ａｎｄｔｈｅａｎｔｉｖｉｒａｌａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓｍｅｔｈｏｄ

ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｈａｌｌｅｎｇｅｔｅｓｔｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｏｍａｔｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．

Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：Ｍａｙ２６，２０１０　　Ａｃｃｅｐｔｅｄ：Ｊｕｎｅ２９，２０１０ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｏｐｅｒａｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ（２００８ＤＦＡ３０５６０）；ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＳｐｅｃｉａｌＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆ９７３Ｐｒｏｇｒａｍ（２００８ＣＢ１１７０１８）；ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｆｏｒＨｉｇｈＬｅｖｅｌｏｆＴａｌｅｎｔｓｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＲＣＺＸ２００７３２）．

ｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｘｂｃ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎＣ

ＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ

Ｍａｔｅｒｉａｌｓ

ｐｉＲＤＧ１２ａｎｄｐＢｉ３５ＳＧ１２ｗｅｒｅｓａｖｅｄｂｙＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｒｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＴＯＰ１０ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｗａｓｐｕｒｃｈａｓｅｄｆｒｏｍＳｈａｎｇｈａｉＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ；ｐｌａｎｔｔｏｔａｌＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔｗａｓｐｕｒｃｈａｓｅｄｆｒｏｍＴｉａｎｇｅｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙ；ＡＭＶｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎ

，ＴＮＡｌｉｇａｓｅ，ａｎｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔｓｃｒｉｐｔａｓｅ４Ｄ

ｗｅｒｅｐｕｒｃｈａｓｅｄｆｒｏｍＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｗｅｒｅｐｕｒｃｈａｓｅｄｆｒｏｍＳｈａｎｇｈａｉＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ．ＴｏｍａｔｏｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓＮＳ０４ｗａｓｓａｖｅｄｂｙＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｒｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｏｔａｌＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ　ＴｏｔａｌＲＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｏｒｍＮｉｃｏｔｉａｎａｇｌｕｔｉｎｏｓａｗｈｉｃｈｈａｄｓａｖｅｄｔｏｍａｔｏＮＳ０４ｉｓｏｌａｔｅｓ，ａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｉｎａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈＲＮＡｓｉｍｐｌｅＴｏｔａｌＲＮＡＫｉｔｍａｎｕａｌｏｐｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍＴｉａｎｇｅｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙ．Ｐｒｉｍｅｒｓｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎＧｅｎｂａｎｋ，ｔｈｅＶｅｃｔｏｒＮＴＩｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙＳｈａｎｇｈａｉＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ．

Ｔａｂｌｅ１　ＰｒｉｍｅｒａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＣＭＶ２ＳＰ１ＣＭＶ２ＡＳＰ２ＣＭＶ２ＳＰ３ＣＭＶ２ＡＳＰ４ＣＲ２ＢｇＣＲ２ＫｐＣＲ２ＳＢ

ＧＴＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＴＣＡＡＴＣＴＣＧＡＡＧＧＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＡＧＴＴＣＴＣＡＣＣ

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ＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＡＴＧ　　ＢｇｌＩＩＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＴ　　ＫｐｎＩＧＧＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴ

ＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ

ＣＭＶ　ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｔｏｔａｌＲＮＡｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎ

７０

ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ．Ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ

，ｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｔｈｅｗａｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ

ｕｓｅｏｆｔｈｅＣＭＶ２ＳＰ１／ＣＭＶ２ＡＳＰ２，ＣＭＶ２ＳＰ３／ＣＭＶ２ＡＳＰ４ｏｆｔｈｅｄｅｓｉｇｎｐｒｉｍｅｒｓＣＭＶＲＮＡ２，ａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅＤＮＡＭＡＮ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．２．２，Ｌｙｎｎｏｎ

）ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅＢｉｏｓｏｆｔ

［９］

ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｓｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｐｒｉｍ，ａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｐｒｅｓｅｒｖｅｄｏｎｔｈｅＴｖｅｃｔｏｒｗａｓｅｒｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ，ｔｈｅｔｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓＣＲ２Ｋｐ／ＣＲ２ＳＢａｎｄＣＲ２Ｂｇ／ＣＲ２ＳＢｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．１１，Ｎｏ．５，２０１０

ａｃｉｄｈｏｍｏｌｏｇｙｗａｓｏｆ７１．３％－９８．８％ａｎｄ７４．０％－９８．５％

（Ｔａｂｌｅ３），ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅＮＳ０４ｉｓｏｌａｔｅｈａｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈＰｈｙｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈｗａｓｆｒｏｍＺｈｅｊｉａｎｇｏｆＣｈｉｎａ，ｔｈｅＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒｗａｓＤＱ４１２７３１（Ｆｉｇ．２），ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎ

ｏ

ｆｒａｇｍｅｎｔＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫａｎｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ　ＡｆｔｅｒｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫｗａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＢａｍＨⅠａｎｄＫｐｎⅠｄ

ｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｄｉｇｅｓｔｅｄｐｉＲＤＧ１２ｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄ

，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２．Ｓｆｉｒｓｔｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ（Ｆｉｇ．１Ａ）．ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｗａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＢｇｌⅡａｎｄＳａｃⅠｄ

ｉｇｅｓｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｄｉｇｅｓｔｅｄｐｉＲＤ＿ＣＲ２．Ｓｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄ

，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２ｓｅｃｏｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｇａｉｎｅｄ（Ｆｉｇ．１Ｂ）．ＡｆｔｅｒｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２ｖｅｃｔｏｒｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＸｂａⅠａｎｄＥｃｏＲⅠ，ｔｈｅｓｍａｌｌｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｄｉｇｅｓｔｅｄｐＢｉ３５ＳＧ１２，ａｎｄｆｉｎａｌｌｙｔｈｅｐＢｉ３５ＳＣＲ２

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ（

Ｆｉｇ．１Ｃ），ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｄｗｉｔｈＶｅｃｔｏｒＮＴＩａｓｓｉｓｔ

．

Ｆｉｇ．１　ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｉＲＤＣＲ２．Ｓ（Ａ），ｐｉＲＤＣＲ２（Ｂ）ａｎｄ

ｐＢｉ３５ＳＣＲ２

（Ｃ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｏｔｏｂａｃｃｏ　Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ

ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＧＶ３１０１，ｔｈｅＮｉｃｏｔｉａｎａｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｔ）ｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｃｕｔｉｎｔｏ１ｃｍｏｆｌｅａｆｄｉｓｃ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈｅｎｍｉｘｅｄｗｉｔｈＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｆｏｒ５－１０ｍｉｎｏｆｓｏａｋｉｎｇ，ｔｈｅ

ｅｘｃｅｓｓｂａｃｔｅｒｉａｌｉｑｕｉｄｗａｓｒｅｍｏｖｅｄａｎｄｄｒｉｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｐｌａｃｅｄｏｎｔｈｅｃｏｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ（

ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌｏｆ６ＢＡ），ａｆｔｅｒｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎｄａｒｋｆｏｒ１－３ｄ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｔｒａｎｓ

ｆｅｒｒｅｄｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ（

ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌｏｆ６ＢＡ＋５０．０ｍｇ／Ｌｏｆ

Ｋａｎ＋３００．０ｍｇ／ＬｏｆＣａｒ）ｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄ．Ｗｈｅｎｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｈｏｏｔｌｅｎｇｔｈｗａｓａｂｏｕｔ１．５－２．０ｃｍ，ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｈｏｏｔｗａｓｃｕｔｏｆｆａｎｄ

ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ（

ＭＳ＋０．１ｍｇ／ＬｏｆＩＡＡ＋５０．０ｍｇ／ＬｏｆＫａｎ＋３００．０ｍｇ／ＬｏｆＣａｒ）ｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｏｏｔｓ．

ＲｅｓｕｌｔｓａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ

ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＭＶＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅ

ＰｒｉｍｅｒｓＣＭＶ２ＳＰ１／ＣＭＶ２ＡＳＰ２，ＣＭＶ２ＳＰ３／ＣＭＶ２ＡＳＰ４

ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ１５５３ａｎｄ１３７８ｂｐ

，ａｆｔｅｒｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓａｎｄｓｐｌｉｃｉｎｇ，ｐａｒｔｓｏｆＣＭＶＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ２８６４ｂｐｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅｓｅｐａｒｔｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｅｎｃｏｄｅＣＭＶ２ａ

ｒｅｐｌｉｃａｓｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＣＭＶ２ｂｐｒｏｔｅｉｎ

，ｂｙｔｈｅｕｓｅｏｆＤＮＡＭＡＮｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣＭＶ２ａｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＮＳ０４ｉｓｏｌａｔｅａｎｄｏｔｈｅｒｉｓｏｌａｔｅｓ（ＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒａｎｄｏｒｉｇｉｎｗｅｒｅｓｈｏｗｎｉｎＴａｂｌｅ２）ｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏ

Ｆｉｇ．２　ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣＭＶ

２ａｉｓｏｌａｔｅｓ

ａｃｉｄｈｏｍｏｌｏｇｙｗｅｒｅ９８．０％ａｎｄ９６．５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｔａｂｌｅ２　ＴｈｅＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＣＭＶｉｓｏｌａｔｉｏｎｓＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒＯｒｉｇｉｎ

ＩｓｏｌａｔｉｏｎｓＡＢ３６８５００ＪａｐａｎＣＭＶＰｆＡＢ０７９８９０ＪａｐａｎＣＭＶ３６ａ１ＡＢ１７９７６５ＪａｐａｎＣＭＶＤ８ＡＢ３６８４９７ＪａｐａｎＣＭＶ４２ＣＭＤＱ３９９５４９ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＢＸＤＱ４１２７３１ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＰｈｙＥＦ２１３０２４ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＣＴＬＡＭ１８３１１５ＳｐａｉｎＣＭＶＰｌ１ＡＢ１８３１１８ＳｐａｉｎＣＭＶＲｉ８ＥＦ２０２５９６ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＴｓｈＤ１０２０９ＪａｐａｎＣＭＶＯＤ８６３３０ＢｅｉｊｉｎｇｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＳＤＥＵ６６５００１ＢｅｉｊｉｎｇｏｆＣｈｉｎａＵｎｋｎｏｗｎＳ７２１８７ＵｎｋｎｏｗｎＣＭＶＫＥＵ７２３５７０ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＰＨｚＦＪ２６８７４５ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＣａｈ１ＡＪ２７６４８０

Ｋｏｒｅａ

ＣＭＶＭｆ

ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｓ

ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅＴｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒａｎｄｈａｄｃｏｒｒｅｃｔａｌｉｇｎｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅＮＣＢＩｄａｔａｂａｓｅｄａｔａｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｂｙｔｈｅｕｓｅｏｆｔｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄｐｒｉｍｅｒｓ

ＣＲ２Ｋｐ／ＣＲ２ＳＢａｎｄＣＲ２Ｂｇ／ＣＲ２ＳＢ

，ｔｈｅＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ６９３ｂｐａｎｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ７４１ｂｐｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ（Ｆｉｇ．３，４）．ＴｈｅｔｗｏｅｎｄｓｏｆｔｈｅＰＣＲ＿ＣＲ２

ＢＫｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｗｏｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆＢａｍＨⅠａｎｄＫｐｎⅠ

，ｗｈｉｌｅＢｇｌⅡａｎｄＳａｃⅠｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｏｔｈｅｔｗｏｅｎｄｓｏｆＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｆｏｌｌｏｗｕｐｖｅｃｔｏｒ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ

ＡｆｔｅｒｔｈｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｏｆＰＣＲＣＲ２ＢＫａｎｄｐｉＲＤＧ１２，ａ

４７６３ｂｐｏｆｐｉＲＤＣＲ２．Ｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ

，ｔｈｅｒｅｗａｓａＣｌａＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｉｎｔｈｅｃｏｎｎｅｃｔｅｄＰＣＲＣＲ２ＢＫｆｒａｇ

ｍｅｎｔ，ａｎｄａ４７６３ｂｐｂａｎｄｗａｓｇａｉｎｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔＰＣＲＣＲ２ＢＫｈａｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｖｅｃｔｏｒ（Ｆｉｇ．５）．ＡｆｔｅｒｔｈｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｏｆＰＣＲＣＲ２ＳＢｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｐｉＲＤＣＲ２．Ｓ，ｐｉＲＤＣＲ２ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ，ｆｉｎａｌｌｙ

ＺＨＡＮＧＹｕｅｔａｌ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉＶｅｃｔｏｒＷｈｉｃｈＲｅｓｉｓｔＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｏｂａｃｃｏ７１

ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｃｏｎｔａｉｎｅｄＰＣＲＣＲ２ＢＫａｎｄＰＣＲＣＲ２ＳＢｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｆｒｏｍｐｉＲＤＣＲ２ａｎｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅｐＢｉ３５ＳＧ１２ｔｏｇａｉｎ

（１１２４８ｂｐ），ａｎｄｔｈｅｆｒａｇｔｈｅｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ

１

２

３

４

５

６

７

８

９

ｍｅｎｔｓｏｆ１４０９ａｎｄ９８３９ｂｐｃｏｕｌｄｂｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＢａｍＨｉｎｇｌｅⅠｓ

，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ

ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ（Ｆｉｇ．６）．

％

１５

１６

１７

１８

１９

１０

１１

１２

１３

１４

Ｔａｂｌｅ３　ＰｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓｏｆＣＭＶ２ａｇｅｎｅｏｆＣＭＶｉｓｏｌａｔｉｏｎｓ

ＡＪ２７６４８０７５．２９８．１９２．６９７．０９３．８８８．９９４．４７５．２９３．０９８．５９９．１９６．７９７．８９３．６９３．１９３．９８６．２９３．２

ＡＢ１７６８４８７１．９７５．６７４．７７５．０７５．６７４．０７５．７９７．６７５．０７５．７７５．８７５．３７５．４７５．４７５．１７５．０７１．３７４．９ＡＢ３６８５００９６．９７１．９９２．６９７．２９３．９８８．７９４．４７５．６９３．０９８．７９８．４９６．８９８．０９３．８９３．１９３．６８６．３９３．６ＦＪ２６８７４５９１．２７２．２９０．７９１．７９５．６８８．４９５．９７４．６９４．８９３．０９３．０９１．７９２．５９５．１９８．１９５．５８５．５９５．１ＡＢ０７９８９０９６．７７１．８９６．５９０．６９３．１８９．０９４．０７５．１９２．４９７．４９７．４９８．５９７．４９３．６９２．２９３．３８６．７９２．９ＡＢ１７９７６５９２．３７２．０９２．０９３．６９１．７８８．９９８．５７５．０９７．３９３．９９４．０９３．０９４．０９６．５９６．３９７．６８６．２９６．３ＥＵ７２３５７０８８．５７１．２８８．０８７．７８８．１８７．９８９．５７３．９８８．３８９．４８９．３８９．１８９．０８９．４８９．０８８．９９４．８８８．８Ｓ７２１８７９２．１７２．１９２．０９３．８９２．０９７．１８７．９７５．１９８．４９４．６９４．６９３．９９４．５９７．３９６．６９８．０８６．６９７．２ＥＵ６６５００１７１．８９７．９７１．８７２．３７１．９７１．８７１．３７１．７７４．４７５．７７５．８７５．４７５．２７４．７７５．０７４．９７１．３７４．６Ｄ８６３３０９１．７７１．６９１．４９３．４９１．３９６．８８７．５９８．８７１．４９３．２９３．２９２．３９３．１９５．８９５．５９６．９８５．４９５．８Ｄ１０２０９９７．５７２．６９７．２９１．１９６．９９２．３８８．３９２．４７２．４９１．８９８．８９７．３９８．７９４．３９３．３９３．８８６．９９３．９ＡＢ３６８４９７９８．３７２．２９６．８９１．１９６．６９１．９８８．２９１．８７２．０９１．３９７．６９７．２９８．１９４．０９３．２９４．２８６．７９３．６ＥＦ２０２５９６９５．９７２．０９５．７９０．５９８．４９１．４８８．１９１．６７２．０９１．０９６．２９６．０９７．２９３．５９２．２９３．２８６．８９３．０ＡＭ１８３１１８９７．２７２．３９６．９９１．１９６．９９２．３８８．４９２．４７２．１９１．８９８．１９７．１９６．１９４．０９２．９９３．６８６．５９３．６ＡＭ１８３１１５９２．３７２．２９１．６９３．３９１．４９４．１８７．９９４．３７１．９９３．７９１．８９１．８９１．１９２．１９５．３９６．０８６．４９５．４ＥＦ２１３０２４９０．９７２．１９０．９９５．９９０．６９３．１８６．８９３．２７１．８９２．８９０．９９０．７９０．４９１．１９２．３９６．４８６．１９５．９ＤＱ４１２７３１９１．８７１．９９１．４９３．３９１．４９６．８８７．６９６．７７１．７９６．３９１．９９１．５９１．１９２．０９４．０９３．１８６．２９６．５ＤＱ３９９５４９８８．３７１．９８７．８８７．５８８．０８８．０９６．５８８．０７１．９８７．５８８．３８８．１８８．２８８．２８７．９８７．０８７．６８６．０

７．５ＮＳ０４ＣＭＶ２ａ９１．９７２．０９１．６９３．６９１．６９４．８８７．５９５．２７１．８９４．７９１．９９１．４９１．４９２．１９３．４９３．４９５．０８

Ｔｈｅｄｏｗｎｌｅｆｔｉｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ，ｔｈｅｕｐｐｅｒｒｉｇｈｔｉｓａｍｉｎｏａｃｉｄｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ．１－１９ａｒｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅＮｏ．ｉｎｔｈｅｌｅｆｔｏｆｆｉｇｕｒｅｆｒｏｍｕｐｔｏｂｏｔｔｏｍ

．

Ｍ：ＤＬ２０００；１：ＣＲ２ＢＫｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｆｉｇ．３　ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲ２Ｂ

Ｋ

Ｍ：ＤＬ４５００；１：ｐｉＲＤＣＲ２．ＳｗｉｔｈＣｌａＩ．

Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓ

ｍｉｄｐｉＲＤＣＲ２．

Ｓ

Ｍ：ＤＬ２０００；１：ＣＲ２ＢＫｓｅｑｕｅｎｃｅ．

Ｆｉｇ．４　ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲ２ＳＢ

ＯｂｔａｉｎｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓＤＮＡｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｐｒｉｍｅｒｓＣＲ２Ｋｐ／ＣＲ２ＳＢ

，ｔｈｅ１．２％ｏｆａｇａｒｏｓｅｇｅｌａｎｄＣＲ２Ｂｇ／ＣＲ２ＳＢｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ

，ｉｔｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｃｌｕｄｅｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗａｓｕｓｅｄｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓ

ｔｈａｔｔｈｅＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ６９３ｂｐａｎｄｔｈｅＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ７４１ｂｐｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ（Ｆｉｇ．７，８）

，

Ｍ：ＤＬ４５００；１：ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｗｉｔｈＢａｍＨⅠ．

Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓ

ｍｉｄｐＢｉ３５ＳＣＲ２

ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓｈａｄｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓ

ｆｕｌｌｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．

７２ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．１１，Ｎｏ．５，２０１０

［１０］

．Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｅｘｐｒｅｓｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ

ｉｃｏｔｉａｎａｔｏｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｈｅＮ

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，ｉｔｃｏｕｌｄｂｅｆｕｒｔｈｅｒａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｏｍａｔｏｐｒｏｅｆｆｅｃｔｗａｓｏｂｖｉｏｕｓ

ｃｅｓｓｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｈａｄｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅａｎｔｉＣＭＶｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｏｍａｔｏｐｌａｎｔｓ．

Ｍ：ＤＬ２０００；１：ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔｒｏｌ；２－５：ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｖｅｃ

ｔｏｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｌｉｎｅｓ；６：ＰＢＩ１２１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ．Ｆｉｇ．７　ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲ２＿ＢＫｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏ

ｂａｃｃｏｐｌａｎｔ

ｓ

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ

［１］ＹＡＮＧＳ（，ＺＨＡＮＧＧＨ（．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎgh）ijk）

（ｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓlmnopqprstuvw

［Ｊ］．ＴｉａｎｊｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（，２００８，１４z{|},-）xy）（２）：５５－５８．［２］ＥＡＭＥＮＳＡ，ＷＡＮＧＭＢ，ＳＭＩＴＨＮＡ，ｅｔａｌ．ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎ

：ｙｅｓｔｅｒｄａｙ，ｔｏｄａｙ，ａｎｄｔｏｍｏｒｒｏｗ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００８，ｐｌａｎｔｓ１４７（２）：４５６－４６８．［３］ＭＡＴＺＫＥＭ，ＭＡＴＺＫＥＡＪ，ＫＯＯＴＥＲＪＭ．ＲＮＡ：ｇｕｉｄｉｎｇｇｅｎｅｓｉｌｅｎ

［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３（５５３２）：１０８０－１０８３．ｃｉｎｇ

［４］ＺＡＭＯＲＥＰＤ，ＴＵＳＣＨＬＴ，ＳＨＡＲＰＰＡ，ｅｔａｌ．ＲＮＡｉ：ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎ

ｄｅｄＲＮＡｄｉｒｅｃｔｓｔｈｅＡＴＰｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｌｅａｖａｇｅｏｆｍＲＮＡａｔ２１ｔｏ２３

Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０００，１０１：２５－３３．ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｉｎｔｅｒｖａｌｓ［

［５］ＳＩＪＥＮＴ，ＫＯＯＴＥＲＪＭ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ＲＮＡｓ

ｏｎｔｈｅａｔｔａｃｋｏｒｏｎｔｈｅｄｅｆｅｎｓｅ？［Ｊ］．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，２０００，２２（６）：５２０－５３１．［６］ＳＨＡＲＰＰＡ．ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００１，

１５（５）：４８５－４９０．［７］ＧＵＯＸＱ（，ＬＵＳＥ（，ＺＨＵＣＸ（，ｅｔａｌ．~ ） ） ）

ＰＶＹ）ｉｎＲＮＡｍｅｄｉａｔｅｄｖｉｒａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ（

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ（ＮＡ Zrps r Ｒ

［Ｊ］．ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ（ ＹpqZ ） Fp

，２００１，３１（４）：３４９－３５６． -d）

［８］ＮＩＵＹＢ（，ＱＩＮＧＬ（，ＺＨＯＵＸＰ（．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ） ）3 ）

（ＲＮＡ ¡ｏｆＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｖｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ

）［Ｊ］．ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（¢£¤¥rpq¦ <=YF§¨©

，２００４，２４（２）：７６－７９．ª）

［９］ＬＩＦ（，ＺＨＯＵＸＰ（，ＬＩＤＢ（，ｅｔａｌ．ｃＤＮＡｃｌｏ«¬）3 ）«­®）

ｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓｏｆＴＭＶａｎｄＣＭＶｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｏｂａｃｃｏｉｎＹｕｎｎａｎｐｒｏｖｉｎｃｅ（¯P° nopq]l

［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇmnopq±²³´ Nµ¤¶·[¸）

：Ａｇｒｉｃ＆ＬｉｆｅＳｃｉ（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ¹ºc--d：|}»Y¼,

，２０００，２６（３）：２６１－２６５．-1）

［１０］ＢＲＵＭＭＥＬＫＡＭＰＴＲ，ＢＥＲＮＡＲＤＳＲ，ＡＧＡＭＩＲ．Ａｓｙｓｔｅｍｆｏｒ

ｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６（５５６７）：５５０－５５３．

Ｍ：ＤＬ２０００；１：ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔｒｏｌ；２－５：ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｖｅｃ

ｔｏｒｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｌｉｎｅｓ；６：ＰＢＩ１２１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ．Ｆｉｇ．８　ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＲ２＿ＳＢｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏ

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ＴｈｅＣＭＶＲＡＮ２ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣＭＶＮＳ０４ｉｓｏｌａｔｅｓ

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，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，ｗｈｉｃｈｒｅａｃｈｅｄ９８．０％ａｎｄ９６．５％ｒｅｆｒｏｍＣｈｉｎａ

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，ａｎｄｖｅｃｔｏｒｗｏｕｌｄｆｏｒｍｈｐＲＮＡｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＲＮＡｉｖｅｃｔｏｒ

ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｆｔｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｈｐＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｃｌｕｄｅｄ

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２００８ＤＦＡ３０５６０）；９７３计划前期研究专项（２００８ＣＢ１１７０１８）；石河子大学高层次人才科研启动项目（ＲＣＺＸ２００７３２）。XYZ4　国际科技合作项目（

１９８４－），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：植物基因工程。通讯作者，教授，博士生导师。=>?@　张瑜（０１００５２６　　DEBC　２０１００６２９-ABC　２

抗黄瓜花叶病毒RNAi载体的构建及烟草的转化

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

张瑜， 郑银英， 赵峰玉， 乔亚红， 崔百明， 向本春， ZHANG Yu， ZHENG Yin-ying，ZHAO Feng-yu， QIAO Ya-hong， CUI Bai-ming， XIANG Ben-chun

石河子大学农业生物技术重点实验室,石河子大学生命科学院,新疆石河子,832003农业科学与技术（英文版）

AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY2010(5)2次

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