医学遗传学实验指导

医学遗传学

实验指导

内蒙古医学院遗传学教研室

目 录

验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 实验二 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 实验三 人类染色体G显带技术 实验四 人类染色体C显带技术 实验五 核仁形成区银染技术 实验六 人类染色体G显带核型分析 实验七 X染色质标本的制备 实验八 姐妹染色单体交换 实验九 微核检测技术

实验十 ABO血型的测定及其基因频率的计算 实验十一 苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算 实验十二 人类皮纹分析 实验十三 遗传咨询

实验十四 人类基因组DNA的提取 实验十五 聚合酶链式反应（PCR） 实验十六 DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验十七 PCR-RFLP技术

《医学遗传学》实验须知

一、医学遗传学实验目的和要求

医学遗传学实验课是医学遗传学课程的重要内容。实验课有助于加深和巩固基础理论知识，并进一步了解和掌握本学科的基本实验内容和操作技能。在培养学生分析问题、综合问题和解决问题能力方面具有重要作用。为此，要求学生做到以下几点：

1、实验课前做好预习，明确实验目的、实验原理。 2、复习有关理论内容。 3、熟悉实验的主要步骤。

4、初步估计和判定实验的可能结果。 二、实验操作过程中的注意事项

1、认真操作，仔细观察和综合分析实验所出现的现象与结果并及时记录。

2、如果实验结果与理论结果不一致，须及时进行科学分析，判断结果的可靠性，寻找出现误差的原因。

3、各种实验试剂用后放回原处，瓶盖封严，轻拿轻放。 4、使用微量加样器时，一定调整好取用量，按使用要求操作。

5、实验室应保持肃静，注意清洁卫生，实验中用过的废弃物品要及时清理，避免堵塞下水管道。

三、实验后的注意事项

1、实验后，整理清洁所用仪器、设备，注意放回原位，以备下次使用。 2、如有仪器损坏，要及时填写破损报告，并报告老师。 3、离开实验室前，检查并关闭门、窗、水、电。 四、实验室的意外处理

实验室如遇着火、烫伤等意外事件发生，必须镇静做紧急处理，并立即报告老师。 1、着火：如遇酒精灯推倒或其它原因着火，首先将一切易燃品移至远处，然后用水扑灭或者切断电源。

2、火伤：皮肤被火灼伤，用烫伤软膏涂抹，如伤势较重，立即送医院治疗。 3、如有毒药品泼溅到皮肤上，如EB，同位素等，应用大量清水进行清洗，必要时，去医院处理。

4、割伤出血：遇玻璃割伤出血，可用碘酒或红药水消毒后，用纱布包扎。如有玻璃留在伤口，处理前应先取出。

实验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备

【目的要求】

1、初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法。 2、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法

【实验原理】

人体外周血淋巴细胞培养(人体末梢血、微量全血短期培养)及其染色体标本制备是国内外研究显示染色体最常用和效果最好的方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便，现已广泛应用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的诊断等。

人体外周血中的小淋巴细胞，是已分化、处于G0期的细胞，几乎不具有分裂增殖能力。在离体血培养细胞中很难找到正在分裂的淋巴细胞，因此，需采用刺激细胞增殖的措施。人们发现从云豆(菜豆)中提取的植物血球凝集素(植物血凝素，PHA)可以刺激小淋巴细胞进行有丝分裂，即在PHA作用下，处在G0期的小淋巴细胞可转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞具有分裂能力，重新进入增殖周期进行有丝分裂。在PHA作用下体外培养72小时左右，多数淋巴细胞已处于细胞周期的第二周期。此时，细胞分裂相较多，但都处于分裂的不同时期。一般来说，制作染色体标本主要是显示细胞分裂中期染色体，因中期染色体形态最为典型、最为清晰，最易辨认，是研究染色体的最好阶段。为了获得大量可供分析的中期染色体，需在终止细胞培养前数小时加入适当浓度的有丝分裂阻断剂——秋水仙素(或其衍生物秋水仙胺)。它可特异地抑制纺锤丝的形成、阻抑分裂中期活动而使细胞分裂停滞于中期。借此可获得大量中期分裂相细胞。

在进行染色体标本制备的过程中，首先要进行低渗处理，使细胞体积胀大、染色体松散开而便于观察分析。最常用的低渗液为0.075mol／L的KCl，也可用水或1％枸橼酸钠等。低渗后的细胞需用固定液固定。醋酸固定液具有膨胀、固定作用。它和醇类混合固定，有利于染色体松散，可获得分散好、易于分析的分裂中期染色体标本。现在常用的固定液为甲醇-冰醋酸(3:1)固定液。

【实验准备】 1、试剂

RPMI-1640营养液、小牛血清、0.25％ 胰蛋白酶、Hanks液、双抗(青霉素、链霉素)、 2％碘酒、75％酒精、3.8％NaHC03、520U／mL肝素、40μg／mL秋水仙碱、PHA、0.075mol／L KCl低渗液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液、二甲苯和香柏油等。

2、器材

超净工作台、光学显微镜(附照相设备)、隔水式恒温培养箱、离心机、冰箱、高压蒸汽消毒锅、鼓风干燥箱、无菌正压滤器、分析天平(感量1／10毫克)、架盘天平、链霉素培养瓶及瓶塞、肝素小瓶及瓶塞(取血用)、10mL吸管、直头小吸管、5mL刻度离心管、2mL或5mL一次性注射器、量筒、烧杯、搪瓷盆、搪瓷盘、试管架、片盘、片盒、止血带、棉签、大吸

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球、小吸头、pH试纸、废液缸、解剖剪刀、镊子、记号笔、4C预冷的载玻片、酒精灯、火柴、染色缸或染色玻璃板和擦镜纸等。

【实验材料】 人静脉血

【实验内容、方法】 一、采血

在采血前，对各种用品进行清洗、无菌处理，配制、分装并冻存培养液(5mL／瓶)，用5mL注射器抽取肝素0.1mL，备用。

常规消毒肘部皮肤，用抽取肝素的注射器静脉采2mL，轻轻摇匀，待接种培养。 二、接种培养

将事先配制冻存的装有5mL培养液的链霉素培养瓶或其它培养瓶从冰箱中取出，置室温

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融化，每瓶滴入约0.3mL肝素抗凝血，轻轻摇匀，置37C培养箱培养72小时。

三、积累分裂中期细胞

在终止培养前2小时，于培养瓶内加入浓度为20μg／mL秋水仙素1滴，终浓度为

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0.1-0.15μg/mL，摇匀，置37C温箱继续培养2小时后收集细胞、制片。

四、制片

1、收集细胞：从培养箱中取出培养瓶，用小吸管将培养物吹打均匀，移人5ml刻度离心管内，以2000r／min离心10分钟，吸去上清液，保留底物。

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2、低渗：每管加入37C预温的0.075mol／LKCL溶液4ml，用吸管轻轻吹打均匀，置0

37C水浴锅中低渗30分钟，以达到红细胞破坏、淋巴细胞膨胀和染色体分散之目的。

3、预固定：低渗处理后，每管加入1 mL甲醇：冰醋酸(3:1)固定液，将细胞轻轻吹打均匀，置离心机2000r／min离心10分钟。

4、固定(一)：去上清液，加固定液5mL，吹打均匀，固定30min,2000r／min离心10分钟。

5、固定(二)：去上清液，再加入5mL固定液，吹打均匀，再次固定30min，2000r／min离心10分钟。

6、滴片：去上清液，留底物，每管加入少许(约0.2mL)固定液，将底物吹打均匀，制成细胞悬液。然后用吸管吸取混匀的细胞悬液，约以20cm或更高的距离滴至预冷的载玻片上，每片约2～3滴，随即将玻片在酒精灯火焰上微烤(一过性微烤数次)，以助细胞、染色体分散，使之均匀平铺于玻片上。将制片放人片盘，空气干燥后，收集于片盒中。

7、染色和观察：待制片晾干后，放入约1:10 Giemsa染液的染色缸中染色15分钟左右，或架在染色用玻璃板上扣染15分钟左右(扣染是指染色时，将染色体制片的细胞面朝下，架在玻璃板上，将染液滴入玻璃板和细胞面之间)，自来水轻轻冲洗，晾干后光镜下观察。先用低倍镜观察后，选择分散好的染色体换为高倍及油镜观察，注意人类核型中近端、亚中和中着丝粒染色体的形态特点。

【注意事项】

1、有关淋巴细胞培养的注意事项同实验十二。

2、PHA的质量是人体外周血淋巴细胞培养成败的关键，不同来源或同一厂家的不同批号、不同的保存时间，PHA的效价可能会有较大的差异，直接影响培养细胞中分裂细胞的数量。故每批PHA正式使用前，须进行一次预实验，摸索PHA的质量和使用量。其使用量不宜过大，否则会导致红细胞凝集。一般，自己直接从菜豆中提取的PHA效果较好。

3、接种的血样标本愈新鲜愈好。肝素用以抗凝，用量不宜过多。

4、秋水仙素用量和作用时间要适当。该药有强烈的毒性作用，用量过大、作用时间过长，可使染色体缩短和发生异常分裂现象，甚至染色体破碎。

5、低渗是制片好坏的重要环节。低渗液用量的多少与作用时间的长短都会影响染色体的制片质量，如染色体分散不好、有胞浆背景，或细胞破损、染色体丢失等。要注意低渗液

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使用前需37C温箱预温。

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