脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定

脯氨酸在植物中的合成与相关酶活性测定

已证明高等植物体内存在2条脯氨酸合成途径，根据初始底物的不同分别命名为谷氨酸途径和鸟氨酸途径。谷氨酸（Glu） 是前者的初始底物，鸟氨酸（Orn）是后者的底物。在植物中，谷氨酸途径认为谷氨酸通过两步连续的还原合成脯氨酸，Δ-吡咯啉-5-羧酸（P5C）为中间产物；催化反应的酶为P5C合成酶（P5CS）和P5C还原酶（P5CR）。鸟氨酸途径中GSA是由转氨基作用生成的，后生成P5C，最终被P5CR还原成脯氨酸。Delauney等人认为，在渗透胁迫条件下，P5CSmRNA和δ-OATmRNA表达与植物体内的氮素水平有关，在渗透胁迫和低氮条件下谷氨酸途径占主导地位，而在非胁迫及高氮条件下鸟氨酸又居于主导地位。

调控植物体内脯氨酸含量高低的另一主要因素是脯氨酸的降解与代谢，降解过程基本是合成途径的逆过程，脯氨酸在线粒体中，通过脯氨酸脱氢酶（ProDH）和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH）的作用生成谷氨酸。

植物脯氨酸合成和降解有关的酶

Δ-二氢吡咯-5-羧酸合成酶（P5C synthetase，P5CS）和P5CR是谷氨酸途径中的两个关键酶，其中P5CS催化第一步反应，P5CR催化最后一步反应，第一步反应为限速反应。P5CS不仅具有谷氨酸激酶（γ-GK）的活性，也具有谷氨酸半醛脱氢酶（GSADH）的活性，即它是一个双功能酶，而且是合成反应的关键酶。渗透胁迫时植物体内积累Pro，而Pro积累与相应酶基因的有关。P5CS基因在正常和胁迫条件下对植物中脯氨酸合成水平等方面均起着重要作用。Roosens等研究表明盐胁迫下4周龄的拟南芥植物P5CSmRNA表达却达到较高水平。另一方面，P5CR基因受胁迫的影响不大，大豆P5CR基因的转基因烟草植株体内P5CR含量显著上升，但Pro并未明显积累。相反，表达乌头叶菜豆P5CS基因的转基因烟草中产生大量P5CS酶蛋白，Pro合成比非转基因植株上升10倍，这些结果表明，脯氨酸的增长受P5CS的影响要大于受P5CR的影响。袁星星等研究证明，CO预处理还可有效提高盐胁迫下小麦幼苗根中吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性及其基因的表达，同时抑制脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性，从而诱导脯氨酸的大量合成，缓解盐胁迫对小麦幼苗的伤害。说明P5CS是胁迫下植物细胞中Pro合成的关键酶。

δ-OAT是脯氨酸合成的鸟氨酸途径中的关键酶，有研究表明，拟南芥在盐胁迫和正常条件下，幼小植株的δ-OAT活性和mRNA都稍微高于较老植株，并且该基因的表达与盐胁迫和脯氨酸产物密切相关。余光辉等对假俭草的研究表明，在水分胁迫条件下，δ-OAT的活性却显著增高，δ-OAT的活性与脯氨酸的累积呈显著的正相关（r=0.96），而P5CS的活性与脯氨酸的累积呈负相关（r=-0.93）。这说明假俭草植物脯氨酸的累积主要受到δ-OAT活性的调节。吴亮其等将拟南芥δ-OAT基因采用基因枪法导入粳稻品种中，通过PCR及分子杂交分析的方法确定了δ-OAT基因己插入水稻的染色体当中并且超量表达。通过检测结果表明，

水稻在受到水分胁迫时会积累大量的脯氨酸，而转基因水稻积累的脯氨酸是对照组的5-15倍。说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要的作用。

脯氨酸降解由脯氨酸脱氢酶（ProDH）和吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH）催化的。Peng Z等克隆编码ProDH的cDNA，该cDNA有一段序列具有输入线粒体蛋白的信号肽特征。并且，通过免疫的方法检测发现，线粒体中有ProDH基因的表达产物吡咯啉-5-羧酸。有研究证明，把ProDH（脯氨酸降解酶）反义基因AtProDH的cDNA转到拟南芥植物中，从而抑制了脯氨酸脱氢酶的产量，抑制了脯氨酸的降解，提高了细胞内脯氨酸含量，增强了植株的抗渗透性，结果明显提高转基因植株对逆境的耐受性，提高对胁迫的抗性。植物中编码P5CDH的cDNA克隆分离还没未见报导。

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性的测定

P5CS酶活性测定参照Hayzer等与韩晓玲的方法，采用盐酸羟胺比色法测定。 1、酶液提取：称取水稻叶片0.5-1g，加入3倍体积提取缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl pH7.5，10 mol/L MgC12，2mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），2%PVP），冰浴研磨，匀浆4℃冰冻离心（20，000g）20min，取上清液，残渣重复提取一次，合并两次上清液，即为酶提取液。

2、酶活性测定：取上述制得的1mL酶提取液加入3mL反应混合液（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.0，内含20 mmol/LmgCl2，10 mmol/LATP，100 mmol/L盐酸羟胺，50 mmol/LL-谷氨酸）中，立即于37℃水浴中反应15 min，取出，迅速向反应管中加入3mL反应终止缓冲液（5 mol/L HCI中含5tCl3和12%三氯乙酸），离心除去沉淀蛋白，上清液于535nm波长下比色，以未加ATP的反应管作为空白对照。酶活性以u·g-1 Fw表示，一个酶活单位（U）定义为每分钟生成1μmolγ-谷氨酞胺所需要的酶量。

鸟氨酸转氨酶（δ-OAT）活性的测定

鸟氨酸转氨酶活性的测定参照余光辉等的方法。

1、酶液提取：称取样品0.5-1g，用50mmol/L的磷酸缓冲液（pH8.0，含1mmol/L二硫苏糖醇（DTT）），冰浴研磨成匀浆后9，000rpm 4℃下离心20min，上清液为OAT粗酶，4℃保存备用。

2、酶活性测定：反应体系为：50mmol/L磷酸缓冲液、35mmol/L L-鸟氨酸、5mmol/L a-酮戊二酸和0.05mmol/L磷酸吡哆醛混合，总体积为0.9mL，加入0.1mL酶液，在25℃条件下反应20min后加入0.3mL3mol/L高氯酸终止反应，然后加0.2mL2%茚三酮，沸水中加热20min进行染色，冷却离心后弃去上清液；用1.5mL无水乙醇溶解红色沉淀物，离心后取上清液510nm测定其吸收值。产物P5C与茚三酮生成的红色物质摩尔消光系数为16.5mmol/L·cm。以每h生成1mmolP5C的量为一个δ-OAT活性单位（U）。

脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性的测定

脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性的测定参照赵福庚等的方法测定。

1、酶液提取：称取样品0.5-1g，加2倍体积提取缓冲液（W/V）于冰浴中研磨，提取缓冲液为0.1mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4；（pH7.8），内含EDTA1mmol/L。匀浆液经三层纱布过滤后4，000g离心15min。上清液加TritonX-100至终浓度0.15%，涡悬后于冰浴中放置30min，后于20，000g离心20min，上清液用于测定酶活性。

2、酶活性测定：酶活性测定反应混合液体积为2.5mL，内含0.15mol/L的Na2CO3-NaHCO3（pH10.3）缓冲液1.6mL，0.2mL L-脯氨酸0.1mol/L，0.2mL2，6-二氯酚靛酚0.9mmol/L。30℃水浴中保温5min，加入0.5mL（0.8mg蛋白/mL）酶提取液，混合均匀后加入0.2mL吩嗪硫酸甲酯（PMS）试剂（9mg/mL，现用现配），摇匀后立即于600nm下检测光密度变化，以ΔA600nm/g·FW·min为一个酶活力单位（U）。

苯甲基磺酞氟（PMSF） P8290 PVP40000聚乙烯吡咯烷酮 ATP/ATPNa2 三磷酸腺苷二钠 盐酸羟胺 L-谷氨酸 三氯乙酸 二硫苏糖醇（DTT） 鸟氨酸/L-鸟氨酸 a-酮戊二酸 磷酸吡哆醛/5－磷酸吡哆醛 高氯酸 L-脯氨酸 2，6-二氯酚靛酚 吩嗪硫酸甲酯（PMS） 曲拉通100 2 1 2 1 2 1 2 2 2 2 1 2 2 2 1g 100g 1g 100g 100g 100g 1g 5g 5g 1g 易爆品 25g 1g 1g 100ml AMRESCO分 AMRESCO分 AMRESCO分 国产 solarbio sigma分 merck分 solarbio sigma分 AMRESCO分 订不了 solarbio alfa sigma分 AMRESCO分 30 70 20 53 30 140 25 35 70 140 35 140 176 20 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右 1周左右

参考文献：

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