高级生物化学（摘要）

高级生物化学

第一章 绪 论

一、

发展中的生物化学

生物化学是在生物学发展的基础上融合了化学、物理学、生理学等学科的理论和方法形成的科学，是研究动物、植物、人体、微生物等生命物体的化学组成和生命过程中的化学变化的一门学科，所以人们认为生物化学是生命的化学。

生命是发展的。生命起源、生物进化、人类起源等等均已说明生命是发展的，因此人们对生命化学的认识也是在发展之中的，生物化学的发展可以追寻到18世纪下半叶（在约是乾隆年间），要从拉瓦锡研究燃烧和呼吸说起。

法国著名的化学家拉瓦锡（Attoine—Laureut Lavoisier，1743----1794），他曾经钻研燃烧现象。并进而研究了呼吸作用。在他29岁时开始燃烧的科学试验，发现磷燃烧后成为磷酸，硫燃烧后成为硫酸；磷酸和硫酸分别比磷和硫重，这表明燃烧并不是失去了“燃素”，而是跟氧结合的过程。他又利用天平和量热器，测量了豚鼠等动物在一定时间内的呼吸，定量测定了CO2和释放的热量，从而证实动物的呼吸作用就好象物体的燃烧一样，只不过动物体的燃烧是缓慢和不发光的燃烧。他的研究成果彻底地推翻了“燃素说”，为生命过程中的氧化奠定了基础。

瑞典化学家舍勒（Carl Wilhelm Scheele，1742----1786）从14岁开始就随一位药剂师作了8年学徒，在此期间，他废这寝忘食的学习化学，并利用业余时间进行化学实验。在1770年他28岁时从酒石里分离出酒石酸，以后他又分析了膀胱结石获得了尿酸，分析研究了柠檬酸、苹果酸、没食子酸或称为五倍子酸，分析研究了甘油。舍勒在无机化学方面也有很多贡献，曾经拒绝了柏林大学和英国要他担任化学教授职务的邀请，一生乐于他的化学实验。

这是18世纪的成果，是由化学家通过科学实验，发现了生物体的呼吸作用，发现了生物体的中间代谢产物。所以拉瓦锡和舍勒是两位生物化学的先驱，是生物化学的奠基人。

进入19世纪后，在物理学、化学、生物学方面有了极大的进展，如1804年道尔顿的原子论，1869年门捷列夫的元素周期律，1895年伦琴发现了X—射线，1835年贝采利乌斯说明了催化作用，1859年达尔文发表了《物种起源》，1865年孟德尔的碗豆杂交试验和遗传定律，1848年亥姆霍兹（Helmholtz）找到了肌肉中热能来源，贝尔纳（Bernard）发现了肝脏生糖功能等等。如此多的发现和进展极大的促进了生物化学的发展，而且也是现代生物化学发展的前提。此外，生产的发展，工业的发达和社会的进步也极大地推动了生物化学的发展。

德国化学家李比希（Liebig）是农业化学的奠基人，也是生理化学和碳水化合物化学的创始人之一，他于1826年在德国吉森（Giessen）大学建立了李比希实验室，并首创了在大学进行化学实验的教学。1842年撰写的《有机化学在生理学和病理学上的应用》专著，首次提出了“新陈代谢”这个学术名词。他研究了许多有机化合物，并对脂肪、血液、胆汁和肌肉提取物进行了研究。他有很多杰出的学生，有位叫施洛斯比尔格尔（Julins Schlossberger），是第一位担任生理化学教授职务的

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人，他于1840—1859年间在德国蒂宾根（Tübingen）大学教授有机化学和生理化学。施洛斯比尔格尔逝世后，蒂宾根大学生理化学的盛名延续了一个世纪。历任的生理化学教授都是当时第一流的生理化学专家，具有医学和有机化学的基础，如霍佩—赛勒（Hoppè—Seyler）、Gustav、Han Thierfelder（研究脂肪氧化）和Franz—Knoop（研究脂肪氧化，尿中排出马尿酸）等。

霍佩—赛勒（1825—1859）是德国医生，因将生理化学（即生物化学）建立成一门独立的科学而著名。1877年他首次提出了“生物化学”这个名词，创办和编辑了第一种《生理化学杂志》，出版了《生理化学及病理化学分析手册》，首次获得了纯的卵磷脂，并曾获得晶体状的血红素。首创“蛋白质”一词，又研究过代谢、叶绿素及血液。他研究病理液体和脓细胞，从而导致他的一位学生Friedrich Miescher（1844—1895）从脓细胞核中分离出了脱氧核糖核蛋白，另一位学生Albrecht Kossel（1853—1927）因对蛋白质、细胞及细胞核化学的研究而获得1910年诺贝尔生理学或医学奖。霍佩—赛勒建立了著名的斯特拉斯堡研究所，并在此担任过生理化学教授，在科学研究和培养学生方面都做出了巨大的贡献。总之，自1840—1900年间，德国的生理化学跟其他领域的科学一样，处于开拓和领先地位。并对美国的生理化学的发展起了非常重要的推动作用。例如，池廷登（Russel Henry Chittendlen）是美国留德学生，回到美国纽黑文的耶鲁大学教授生理化学，是全美第一位任生理化学教授职务的留德归美学生。他在生理化学方面任教达30年，居美国生理化学的领导地位。他与他的德国老师寇南（Willy Kühne）合作对胃液和肠液消化过程的产物进行了化学研究，发现了不少新东西。也进行了蛋白质的分解试验。再如，艾贝尔（John Jacob Abel，1857—1938）曾在德国留学7年，获斯特拉斯堡大学医学博士，返美后在密西根大学和约翰斯·霍普金斯大学任教，他分离了肾上腺素。1962年制成了胰岛素晶体。1932年领导内分泌研究室。

总的说来，美国生理化学初始阶段受德国的影响较深。

20世纪后，生物化学有了很大的发展。德国、美国、英国、法国都有了生物化学的学术中心。就生物化学来说，20世纪前半叶，在蛋白质、酶、维生素和物质代谢及生物氧化方面都有了很大的发展。

霍普金斯（Sir Frederick Gowland Hopkins，1861—1947）是英国剑桥大学生物化学教授，因发现维生素而与荷兰的艾克曼（C.Eijkman，1858—1930）共获1929年的诺贝尔生理学或医学奖。霍普金斯创建了剑桥大学普通生物化学学派和中心，从事教学和研究的人员都是生物化学方面的精英，为生物化学的发展做出了较大的贡献。

20世纪初直至二战前夕，德国在生物化学方面仍占领先地位，如埃米尔·费歇尔（Emil Fischer，1852—1919），普鲁士化学家，研究糖和嘌吟类物质，获1902年诺贝尔化学奖。汉斯·费歇尔（Hans Fischer，1881—1945），德国生物化学家，因对血红素和叶绿素的研究而获诺言贝尔化学奖。迈尔霍夫（Otto Meyerhof，1884—1951），德国生物化学家，因研究肌肉代谢的糖原—乳酸循环与英国的A.V.Hill共获1922年的诺贝尔生理学或医学奖。威尔施泰特(Richard

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Willstatter，1872—1942)，德国化学家，研究叶绿素及其植物色素结构而获得1915年诺贝尔化学奖。温道斯（Adolf Windaus，1876—1959），德国有机化学家，因研究维生素等有重要生物学作用的物质而获得1928年的诺贝尔化学奖。瓦尔堡（Otto Warburg，1883—1970），德国生物化学家，因对细胞呼吸的研究而获1931年诺贝尔生理学或医学奖。

在留德学生的推动下，20世纪前半叶，美国的生物化学方面也的很大发展。如耶鲁大学池廷登的后继者门德尔（Lafayette Benedict Mendel，1872—1935），美国生物化学家，发现了维生素和蛋白质的营养价值，建立了现代营养学概念。20—30年代营养和维生素的研究在美国比较突出。再如哈佛医学院的福林（Otto Folin），于1909年任生物化学教授，1915时福林教授将哈佛大学生物化学系办成了有影响的学术中心，重点放在分析方法和临床应用研究上。福林建立了尿中肌酸和肌酸酐的测定方法，氨基酸测定方法，尿氮测定方法。福林和吴宪（我国生物化学家）于1919—1922年设计了血液分析的颜色测定方法。

大约从20世纪中叶起，生物化学得到了突飞猛进地发展，并且生物化学的领域也向深度和广度发展，其原因是：①物理学家、化学家以及遗传学家等参加到生命化学的领域中来了。②研究人员迁居和交往频繁。③研究方法有了突破和改进。④信息交流量增大。

从研究方法的改进上来说，相继出现了色谱技术、电泳技术、超速离心技术、荧光分析技术、同位素示踪技术以及电子显微镜的应用等。可以说生物化学的分离、纯化和鉴定的方法向微量、快速、精确、简便和自动化的方向发展。

从不同学科专家的参与上来看，英国物理学家肯德鲁（John Cowdery Kendrew）测定了肌红蛋白的结构。英国物理学家佩鲁茨（Max Ferdinand Perutz）用X—射线衍射技术分析了血红蛋白的结构，二人共获1962年的诺贝尔化学家。美国化学家鲍林（Linus Pauling）因确定了氢键在蛋白质结构中及大分子间相互作用的重要性，并认为某些蛋白质具有类似螺旋的结构，研究了镰刀型贫血病，提出了“分子病”的名称，获得了诺贝尔化学奖和和平奖。桑格（Frederick Sanger）英国生物化学家，经过10年的研究，于1955年确定了牛胰岛素的结构，获得了1958年的诺贝尔化学奖。1980年他又设计出了一种测定DNA核苷酸排列顺序的方法，而与吉尔伯特（Walter Gilbert）、伯格（Pall Berg）共获1980诺贝尔化学奖。麦克林托克（Barbara Mc Clintock）美国遗传学家，从事玉蜀黍遗传研究40年，发现了可移动的遗传成分，因而获得了1983年的诺贝尔生理学或医学奖。

生物化学领域中，在20世纪获得诺贝尔奖的成果还有：克雷布斯（Sir Hans Adolf Krebs，英籍德裔生物化学家，犹太人，1933年被迫迁居英国）1937年发现三羧酸循环。李普曼（Fritz Albert Lipmann，美籍德裔生物化学家）1947年成功的分离出了CoA，1953年确定了其分子结构。克雷布斯和李普曼二人共获1958年诺贝尔生理学或医学奖。奥乔亚（Severo Ochoa，美籍西班牙生物化学家）发现细菌内的多核苷酸磷酸化酶，并合成了核糖核酸。科恩伯格（Arthur Korberg，美国医师、生物化学家）发现DNA在细胞内及试管内的复制方式。奥乔亚和科恩伯格

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二人共获1959年诺贝尔生理学或医学奖。威尔金斯（Maurice Wilkins，新西兰出生的英国物理学家）完成了对DNA的X—射线衍射分析，沃森（James Dewey Watson）和克里克（Francis Harry Compton Crick）提出了DNA的双螺旋结构，三人共获1962年的诺贝尔生理学或医学奖。尼伦伯格（Marshall Warren Nirenberg，美国生物化学家）破译遗传密码，霍利（Robert William Holly）阐明酵母丙氨酸tRNA的核苷酸的排列顺序，并证明所有tRNA的结构类似，科拉纳（Har Gobind Khorana，美籍印度裔生物化学家）首次人工复制出酵母基因，三人共获1969年诺贝尔生理学或医学奖。莫诺（Jàcques Momod，法国生物化学家、遗传学家）和雅各布（Francois Jacob，法国生物学家）发现了操纵子而获得1965年诺贝尔生理学或医学奖，等等。

我国生物化学的主要先驱是吴宪，他曾留学美国哈佛大学，回国后于1924—1942年担任私立北京协和医学院生物化学教授，兼生物化学系主任教授。我国在生物化学研究中最突出的成就是1965年人工合成了牛胰岛素，1983年人工合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸。此外我国在酶的作用机理、血红蛋白变异、生物膜结构与功能等方面都做出了国际水平的研究成果。

生物化学在蛋白质、核酸、酶及代谢等方面已有理论方面的成就，理论成果必将导致应用，所以生物化学的发展推动了生物技术的进步，从80年代开始，生物工程和生物高技术得到了迅速发展。生物工程有遗传工程或基因工程，蛋白质合成的分子生物学，或称蛋白质工程、酶工程，还有组织培养、细胞培养，以及其他体外技术，以求生产出对人类有用的产物。有工业微生物学，利用合适原料经过发酵，生产酶类或人类食品和动物饲料。生物工程的远景包括应用于人类健康、动物疾病治疗与预防、污水和废物处理、以及生物电子学等等。由于生物工程对人类社会目前效益的广阔的前景，世界各国，特别是欧洲、澳洲、日本等国家比较重视，发展较快。我国也已重视生物工程的理论研究和应用研究，特别重视生产方面的开发研究。

生物化学虽然有近二百年的历史，但是还在发展之中。目前看得到的一些未知领域正受到日益的重视，例如：地球上的生命是怎样起源的？地球以外的天体上有没有生命？遗传物质是怎样进化的？一个受精卵中的遗传物质怎样发生成个体？怎能样发生为各种器官和组织的？细胞器的进化途经还有争论，癌的问题、病毒问题、人体自身免疫问题、大脑的记忆、推理的分子生物学、生物行为有什么规律，其分子的基础又是什么？还有环境生态等问题。总之，生物化学是在发展之中。

二、

生物化学方面的主要期刊

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中文：

中国科学 科学通报

生物化学与生物物理学进展 生物化学与生物物理学学报 生命的化学 生物化学与分子生物学学报 微生物学报 遗传学报 实验生物学报 生物科学动态 日文：

科学 自然

生化学 蛋白质、核酸、酵素 英文：

Nature（London） Science（Washington）

Analytical Biochemistry（New York） Bidchemical Journal（London） Archives of Biochemistry and Biophysics（New York）

Biochemical and Biophysical Research Communications（New york） Biochimica et Biophysica Acta（Amsterdam）

Biochemistry（USA） Bioorganic Chemistry（London） Biopolymers（New York）

Biotechnology and Bioengineering（New York） Canadian Journal of Biochemistry（Canada）

Cancer Research（USA） Chromosoms（Berlin） Comparative Biochemistry and Physiology（Oxford）

Current Advances in Genetics and Molecular Biology（U.K.） European Journal of Biochemistry（Heidelberg）

Enzyme（Basel） Experimental Cell Research（New York） Federation Proceedings（New York）

General Cytochemical Methods（New York）

Immunology（Oxford） Indian Journal of Biochemistry（Indian） International Journal of Biochemistry（Oxford）

International Journal of Peptide and Protein Research（Copenhagen） Journal of the Americal Society（Washington）

Journal of Bacteriology（USA） Journal of Biochemistry（Tokyo） Journal of Biological Chemistry（USA） Journal of Cell Biology（New York） Journal of Chromatography（USA） Journal of Electron Microscopy（Tokyo） Journal of Experimental Biology（London） Journal of General Microbiology（london） Journal of General Virology（London）

Journal of Histochemistry and Cytochemistry（USA）

Journal of Immunology（USA） Journal of Lipid Research（New York）

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Journal of Molecular Biology（London） Journal of Neurochemistry（London） Journal of Theoretical Biology（London）

Journal of the Chemistry Society I.Organic and Bioorganic Chemistry（London） Journal of Virology（Washington）]

Metabolism，Clinical and Experimental（USA） Molecular and Cellular Biochemistry（Hague）

Molecular and Cellular Genetics（Berlin） Molecular Pharmacology（New York） Methods of Biochemical Analysis（New York）

Nucleic Acids Research（USA） Plant Physiology（USA）

Peptides（USA） Preparative BIOchemistry（USA） Proceeding of the National Academy of Sciences（Washington） Proceedings of the Royal Society of London，Series B（London） Protoplasma（Vienna） Steroids（San Fradsisco） TBS（USA） Virology（New York） 德文：

Die Naturwissenschaften（Berlin） Biochemische Zerischrift（Berlin） Zeritschrift fur Naturforschung 法文：

Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de L′Academie des Sciences（Paris）

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第二章 蛋白质生物化学

蛋白质生物化学研究的是蛋白质的结构、性质、和功能及结构与功能的关系。

生物体最重要的组成物质是蛋白质和核酸。核酸是遗传大分子，负责遗传信息的储存与传递。蛋白质是功能大分子，是生物体的结构、性质与功能的具体体现者。例如：遗传信息的复制、传递和表达要依靠各种蛋白质才能完成；细胞的骨架是由许多种蛋白质构成的三维网状结构，而细胞的各种生命活动都是在细胞骨架上进行的；生命的运动依赖于各种运动蛋白；氧的运输要靠血红蛋白来完成；动物体对疾病的抵抗力是由免疫球蛋白执行的；细胞能够认识“自己”与“非己”，是靠糖蛋白的特殊功能；机体的代谢活动要依赖各种酶和激素来完成，酶是蛋白质，激素中有相当一部分是肽类。可见蛋白质在生命活动中无所不在，无时无刻不在发挥着重要功能。近年来发现的羊的瘙痒病（Scrapie）的病因是一种最简单的具有感染性的蛋白因子（Prion）引起的，它是比类病毒还小的微生物，未检查出其含有核酸物质，而只是一种蛋白质颗粒。这是值得人们思考的问题。

要研究蛋白质的功能，首先必须深入了解它们的结构，特别是空间结构（三维结构），因为结构决定功能，生命物质的功能和它的结构二者是统一的，有什么样的结构必有什么样的功能，反之亦然。例如，酶蛋白的催化功能只有在彻底弄清酶的活性中心与底物如何结合，并如何反应，才真正了解那种酶的作用机理。再如，在彻底弄清楚血红蛋白的分子构象及与氧分子结合后的构象的变化之后，才能完整地阐述动物机体中氧和二氧化碳的运载过程。因此，我们本章中首先介绍蛋白质结构原理的最新进展，然后再介绍几类蛋白质的结构与功能的关系及其它的有关问题。

蛋白质的结构很早就受到科学家的关注，但在50年代以前一直未能得到满意的结果。直到1952年丹麦生物化学家林德斯洛姆—兰（Linderstrom—lang）第一次提出蛋白质结构的三级结构的概念，才使蛋白质结构的研究走上了正确的道路。Linderstrom—lang的三级结构概念是：一级结构是指多肽链中氨基酸的顺序，而不涉及其空间排列状态；二级结构是指多肽链骨架（主链）的局部空间结构，不涉及侧链构象，也不考虑与其它肽链片段之间的关系及整个肽链的空间排列状况；三级结构是指整个肽链的折迭情况，或者说是指肽链中全部原子在空间的排列状态。这一概念一提出来，立即得到了科学家的认同。1958年，英国晶体学家在研究蛋白质晶体时发现，有些蛋白质是由几条相同或不同的肽链组成，每条肽链都有完整的三级结构，称之为亚基，几个亚基排列成空间几何状态，并靠非共价键结合在一起。他将这种结构称为四级结构。现在蛋白质的一、二、三、四级结构的概念已由国际生化协会（IUB）的生化命名委员会采纳并作出正式定义。到目前为止已有2000多种蛋白质的一级结构被搞清楚。据1990年4月的统计，有488种蛋白质的三级结构利用X—射线衍射技术在不同分辨率水平上得到了阐明。蛋白质三维结构的研究资料大大丰富了人们对蛋白质空间结构规律的认识，同时，蛋白质四级结构水平的概念也已不能满足人们的要求。因此，近年来蛋白质化学家又在四级结构水平的

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基础上增加了两种新的结构水平，即超二级结构和结构域。超二级结构是1973年罗斯曼（Rossman）提出的，是指蛋白质结构中存在的各种二级结构组合物，是构成三级结构的构件。结构域的概念是由免疫化学家波特（Porter）提出的，是指蛋白质分子中那些明显分开的球状部分。例如，动物的免疫球蛋白（IgG）含有12个结构域。现已证明许多蛋白质含有明显的结构域。这两种新的蛋白质结构概念目前已被生物化学家及分子生物学家所公认。所以，我们所提到的蛋白质结构应包括六级水平的结构。即：

一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→四级结构 蛋白质三维结构的深入研究，不仅从分子水平上深入揭示了生命的奥秘，而且可用于生产实践。例如，80年代兴起的蛋白质工程技术，就是利用现代生物技术改造蛋白质的分子结构，提高其生物活性，使其更加符合人类的需要。所以，将蛋白质生物化学的理论知识应用于生产实践，必将对人类做出更大的贡献。

第一节 蛋白质的一级结构

一、 蛋白质一级结构的内容

蛋白质是不分枝的生物大分子，由20种氨基酸组成（从各种生物体中发现的氨基酸有180种，参与蛋白质组成的基本氨基酸有20种，称为蛋白氨基酸，其它的称为非蛋白氨基酸），氨基酸在多肽链中有一定的排列顺序，蛋白质的一级结构就是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。蛋白质一级结构也称为蛋白质的共价结构。当然，蛋白质一级结构中还应包括二硫键的定位。蛋白质一级结构包括以下几个内容：

1．蛋白质分子中多肽链的数目； 2．每一条多肽链末端氨基酸的种类；

3．每一条多肽链中氨基酸的种类、数目和排列顺序； 4．链内二硫键的位置和数目； 5．链间二硫键的位置和数目。

研究蛋白质一级结构就是要研究这些内容。

蛋白质一级结构的表示方法一般是从左到右表示多肽链从氨基端到羧基端。氨基酸的种类和排列顺序通常用三字母表示，即氨基酸英文名称的前三个字母。但为了更加方便，国际生化委员会推荐了一套单字母表示法。

二、 蛋白质一级结构的测定

1955年，英国生物化学家桑格（Sanger）首先完成了胰岛素一级结构的分析，为蛋白质一级结构的研究开辟了道路。但这项工作花费了他整整十年的时间。随后，唉德曼（Edman）液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱—质谱（GC—MS）等方法相继出现，使蛋白质一级结构的分析速度大大加快。现在分析一个分子量在10万左右的蛋白质只需要几天的时间就可完成。蛋白质一级结构分析

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的综述和专著文献很多，在此我们只作简要的概述。

蛋白质一级结构分析的基本步骤如下； 1．蛋白质样品的纯化；

2．测定N—末端和C—末端氨基酸； 3．至少以两种方式裂解肽链成肽段； 4．肽段的分离纯化； 5．肽段的顺序分析；

6．肽段重迭重组以确定肽链的全部氨基酸顺序； 7．二硫键的定位。

(一)、蛋白质的纯化（均一）

在测定蛋白质的一级结构之前，首先必须保证被测蛋白质样品的纯度，只有均一的蛋白质样品，才能保证顺序测定结果准确可靠；其次要了解它的分子量和亚基数。如果某些蛋白质分子是由两个以上的肽链组成的，第一步必须将多肽链分开。蛋白质多肽链之间有非共价键和共价键（二硫键）作用力。如果只有非共价键，可用脲或盐酸胍等变性剂将其分开。如果肽链之间有二硫键，则需要用拆开二硫键的方法进行处理。拆开二硫键的化学方法主要有以下两种：

1． 过甲酸氧化法 用过甲酸（过氧化氢+甲酸）可使蛋白质分子中的二硫键断裂。反应一般在0℃下进行2小时左右，就能使二硫键中的两个硫全部转变为磺酸基。这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。反应如下：

CH2 S S CH2 HCOOOH、0℃、2h CH2—SO3H 2 —NHCHCO— —NHCHCO— —NHCHCO—

如果蛋白质分子中同时存在半胱氨酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外，甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，从而增加了分析的复杂性。

2． 巯基乙醇原法 利用巯基乙醇亦可使蛋白质中二硫键断裂。高浓度的巯基乙醇在pH8—9、室温下作用数小时后，可二硫键定量的还原为—SH。在此反应系统中还需加入8M脲或6M盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构象，从而有利于巯基乙醇作用于二硫键。此反应是可逆的，因此要使反应完全，巯基乙醇的浓度必需保持在0.1—0.5M。反应如下：

CH2 S S CH2 CH2SH pH8-9、室温、数小时 CH2—SH CH2 S S CH2

+2 2 + —NHCHCO- -NHCHCO— CH2OH 8M脲或6M盐酸胍 —NHCHCO— CH2OH HOCH2

被还原生成的—SH不稳定，极易被重新氧化生成—S—S—，故需要稳定。稳定—SH的方法通常是用碘乙酸（ICH2COO-）使—SH羧甲基化（—SHCH2COO-），

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或者用氰乙烯（CH2=CH—CN）使—SH氰乙基化（—SHCH2CH2CN）。

蛋白质多肽链被拆开后，要将它们分离纯化。常用的分离纯化方法通常有凝胶过滤法、离子交换层析法、电泳法等。分离纯化后的每条肽链再进行末端分析。

(二)、末端分析

分析肽链末端氨基酸的方法很多，常用的有以下几种。 1．N—末端氨基酸分析 ①二硝基氟苯法（DNP或FDNB或DNFB） 此方法是1945年由Sanger提出的，其反应过程如下：

NO2

R1 R2

O2N F + H2N—CH—CO—NH—CH—CO—肽

二硝基氟苯 肽链

NO2

R1 R2

O2N HN—CH—CO—NH—CH—CO—肽 + HF

二硝基苯肽（DNP—肽）

6MHCl

NO2

R1 R

O2N HN—CH—COOH + H2N—CH—COOH

DNP—氨基酸 氨基酸混合物

DNP—氨基酸可用有机溶剂抽提后，通过层析法来鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此法成功地测定出胰岛素的N—末端氨基酸分别为甘氨酸和苯丙氨酸。 ②二甲基氨基萘磺酰氯法（NDS—Cl） 此方法是1956年由哈特利（Hartley）等人提出的。二甲基氨基萘磺酰氯又称丹磺酰氯，简称DNS—Cl。其反应过程如下：

CH3—N—CH3 CH3—N—CH3

R1

PH9.5—10.5

+ H2N—CH—CO—肽 + HCl

R1

SO2Cl SO2—HN—CH—CO—肽

丹磺酰氯 丹磺酰—肽

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CH3—N—CH3

6MHCl + 氨基酸混合物

R1 SO2—HN—CH—COOH

丹磺酰—氨基酸

丹磺酰—氨基酸具有强烈的黄色荧光，可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析法进行鉴定。此法的优点是灵敏度高（比DNP法高100倍），且丹磺酰—氨基酸的稳定性好。

2．C—末端氨基酸分析 ①肼解法 这是分析C—末端氨基酸的最常用方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，可使C—末端氨基酸以游离状态释放出来，而其它氨基酸都与肼反应生成氨基酰肼化合物，此类化合物可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。游离的C—末端氨基酸可采用DNS—Cl或DNP等方法进行鉴定。

②羧肽酶水解法 羧肽酶可以专一地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可分为羧肽酶A、B、C和Y（A和B来自胰脏，C来自柑桔叶，Y来自面包酵母）。应用羧肽酶水解C—末端氨基酸时，首先要进行动力学实验，以便选择合适的酶浓度和反应时间，以保证释放出的氨基酸主要是C—末端氨基酸。

(三)、氨基酸组成分析

在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先要了解它是由哪些氨基酸组成的，每种氨基酸有多少。分析组成的方法有层析法和离子交换层析法两种。层析法是将多肽链用酸完全水解成游离氨基酸，然后进行DNS（Dansyl）标记，聚酰胺薄膜层析。这是一种超微量的分析方法，但用于定量分析尚不够准确。离子交换层析是一种精确的氨基酸组分分析的定量方法 ，它是将多肽链完全水解后，通过离子交换法使各种氨基酸相互分开，再分别进行定量测定。氨基酸自动分析仪就是在此基础上发展起来的。

(四)、多肽链的降解

多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂的，因此直接分析多肽链的氨基酸顺序还是很困难的，多采用将多肽链进一步降解成肽链片段，先分析各片段的氨基酸顺序，再重迭重组确定肽链的全部氨基酸排列顺序。肽链的裂解是蛋白质一级结构研究中的重要问题，它要求裂解点少，选择性强，反应产率高。目前主要有化学法和酶解法两种方法。多肽链的降解至少要用两种对肽链有不同裂解点的方法，降解生成两套以上不同的肽段。否则，将给下一步的重迭重组造成极大的困难。

1． 化学法

最常用的化学法是溴化氢法，此法能选择性地断裂甲硫氨酸的羧基端肽键。溴

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化氢化学降解法的优点是：①一般蛋白质中含甲硫氨酸较少，因此裂解点少，可获得较大的肽链片段；②产率在80%以上；③作用条件温和，在室温下作用几到十几个小时即可。

近年来有一种羟胺法开始受到人们的重视。羟胺能专一地裂解天冬酰胺和甘氨酸之间的肽键（Asn—Gly）。在酸性条件下裂解天冬酰胺和脯氨酸之间的肽键（Asn—Pro）。现已有人将这种方法用在某些蛋白质一级结构的分析上。

2． 酶解法

酶解法比化学法有更多的优越性，使用也更广泛。因其具有较高的专一性，而且水解产率较高，所以可选择各种不同专一性的酶进行专一地裂解。常用的酶及其专一性如下：

氨基酸顺序分析常用蛋白酶及其专一性

酶 名 称 水 解 的 肽 键 胰蛋白酶 Lys（赖氨酸）、Arg（精氨酸）羧基端肽键 胰凝乳蛋白酶 Trp（色氨酸）、Tyr(酪氨酸）、Phe（苯丙氨酸）羧基端肽键 弹性蛋白酶 Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Ala（丙氨酸）羧基端肽键 胃蛋白酶 Tyr(酪氨酸)、Trp（色氨酸）、Phe（苯丙氨酸）氨基端肽键 Arg（精氨酸）、Lys（赖氨酸）、Gly（甘氨酸）、Leu（亮氨酸）木瓜蛋白酶 等羧基端肽键 Phe（苯丙氨酸）、Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Tyr(酪氨嗜热菌蛋白酶 酸)、Trp（色氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Val（缬氨酸）的氨基端肽键 枯草杆菌蛋白酶 疏水侧链氨基酸残基之间的肽键

在酶法裂解肽链时，可适当的选取用一些化学药品来修饰某些氨基酸，以控制酶的专一性，使所得的肽链片段更大一些。例如，用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二酸酐修饰赖氨酸，则胰蛋白酶仅使精氨酸的羧基端肽键断裂，若用1,2或1,3—二羰基化合物修饰精氨酸，则胰蛋白酶仅能裂解赖氨酸羧基端肽键。当然，修饰后的氨基酸还可以解封闭，解封闭后，酶仍能选择性的作用于这些氨基酸的肽键。目前倾向于采用这种裂解方式。

(五)、肽段的分离

肽段的分离方法主要是凝胶过滤法，但单靠凝胶过滤法分离的肽段一般纯度不够，常需辅以离子交换层析法进行纯化。将裂解后的肽段分离纯化后就逐一地进行分析。

(六)、肽段的顺序分析

肽段的氨基酸顺序分析有化学法和酶解法两种。 1．化学法—Edman降解法

这是目前用于顺序分析最主要的方法。它的原理是从N—端开始，逐步降解，降解一个，分析一个。先将肽段与异硫氰酸苯酯（PTH试剂）在pH8—9的条件下

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作用，肽段的游离—NH2末端连接到异硫氰酸苯酯的C原子上，生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC—肽。在强酸（三氟乙酸）作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物(APZ0和一个失去末端氨基酸的肽链，此肽链不被破坏，因而又出现一个新的N—末端氨基酸。重复上述步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析。苯氨基噻唑啉酮衍生物用有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转变为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH—氨基酸），此化合物比较稳定，便于分析鉴定。反应过程如下：

R1 R2

N=C=S + H2N—CH—CO—NH—CH—CO—肽

异硫氰酸苯酯（PTH） 肽段

偶联反应 pH8—9

S R1 R2

NH—C—NH—CH—CO—CH—CO—肽

苯异硫甲氨酰肽（PTC—肽）

环化断裂 CF3COOH（无水）

R2

NH—C S + H2N—CH—CO—肽 +

HN C O CH R1

噻唑啉酮苯胺（ATZ） 肽段（少一个氨基酸）

转化反应 NH—C S N C S 1M HCl +

HN C O O C NH CH CH R1 R1

ATZ 苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH—氨基酸）

这些步骤通常称为Edman逐步降解法。Edman逐步降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。PTH—氨基酸可用各种层析法进行鉴定，如纸层析、薄层层析等。虽然此方法具有很多优点，但由于操作繁琐，工作量大，所以，有人根据Edman降解法的原理作了一系列的改进。例如，1967年形成的液相顺序自动分析仪和1970年形

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成的固相顺序分析仪都是在Edman降解法的基础上进一步改进而成的。再如，1976年有人将Edman降解法的异硫氰酸苯酯试剂改为甲氨偶氮苯—异硫氰酸盐（简称DABITC），这是一种有色试剂，产物DABTH—氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时不需要染色，用肉眼即可分辩。此方法灵敏度高，是目前一种很可取的方法。

2．酶解法 蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶，例如氨肽酶和羧肽酶，它们分别从肽链的N端和C端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过程分别定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。但这种方法实际上有许多困难，局限性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。

另外，质谱法和气谱—质谱（GC—MS）联用法也已用于肽链的氨基酸顺序分析。这是一种不同于Edman降解法和酶解法的物理化学方法，具有一定的发展前途，但目前应用还不十分普遍，其原理我们不再介绍。

(七)、肽段的重迭重组 一但获得用两种不同方法断裂的肽段的全部氨基酸顺序后，就可用重迭重组的方法确定出整条肽链的氨基酸排列顺序。肽段的重迭重组方法我们可通过下面的例子来说明。实际工作中所得到的肽段远比下面的例子中的肽段大的多，但原理是一样的。

例如，有一个肽链，通过末端分析已知N—末端为丙氨酸，C—末端为缬氨酸，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，得一套肽段（A）；再以胰蛋白酶水解，则得到另一套肽段（B）。肽段的顺序分析结果如下：

A：丙—苯丙 + 甘—赖—天冬酰胺—酪 + 精—色 + 组—缬 B：丙—苯丙—甘—赖 + 天冬酰胺—酪—精 + 色—组—缬 推理如下：

A—1 丙—苯丙

B—1 丙—苯丙—甘—赖

A—2 甘—赖—天冬酰胺—酪 B—2 天冬酰胺—酪—精 A—3 精—色

B—3 色—组—缬 A—4 组—缬

此十肽氨基酸顺序为：丙—苯丙—甘—赖—天冬酰胺—酪—精—色—组—缬

(八)、二硫键的定位

蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中含二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽段的顺序，将这两个肽段的顺序与测出的一级结构比较，就能找出二硫键的位置。含二硫键肽段的检出方法如下：

1． 凝胶过滤或离子交换层析

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用凝胶过滤或离子交换层析法分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽段。

2． 对角线电泳或层析

1966年布朗（Brown）和哈特莱（Hartlay）用对角线电泳进行二硫键的定位。此方法是将水解后的肽段混合物先进行第一向电泳，样品点在中间，电泳完毕后，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸汽处理2小时，使二硫键断裂。此时含二硫键肽段的静电荷发生了改变。然后，将纸条缝在另一张纸上，进行第二向电泳，电泳条件均与第一向相同，因此，电泳后各个不含二硫键的肽斑均坐落在纸的对角线上。而那些含二硫键的肽段由于被氧化，电荷发生了改变，在第二向电泳中，其迁移速度不同于在第一向电泳中的速度，所以就此肽斑就偏离对角线。肽斑可用茚三酮显色。对角线法速度快，操作简便，并适用于小分子样品，是直接分离含二硫键肽段的好方法。

二硫键断裂产生的肽段 蛋白质一级结构的分析正向着自动化、

快速化和微量化的方向发展，关键的问题 + 仍然是进一步寻找蛋白质裂解和肽段分离 的方法。近年来又有许多新的方法和思路 第 出现，如X—射线衍射法测定蛋白质一级 二 结构；分离出相应蛋白质的mRNA，测定出 向 mRNA的核苷酸排列顺序，再由mRNA的核

苷酸排列顺序通过密码子排出蛋白质的一 - 级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋 + - 白质一级结构研究工作的发展，使人们掌 第一向 握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。 对角线电泳图解

三、研究蛋白质一级结构的意义

研究蛋白质一级结构对我们了解蛋白质结构与功能的关系、生物进化、预测蛋白质构象等生物学问题都具有重要的意义。在此我们做以简要概述。

(一)、蛋白质一级结构与分子进化

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自然界中的蛋白质有10—10种之多。不同的生物体各有自己的一套蛋白质，但是自然界中还存在着许多同源蛋白质。所谓同源蛋白质是指不同种属的生物体中执行同一功能的蛋白质，如动物体的血红蛋白都具有运输氧的功能，细胞色素C都具有传递电子的功能。从不同生物体的同源蛋白质一级结构的比较研究中发现，它们之间在氨基酸排列顺序上有许多异同，由此反映出了物种的进化，也证实了达尔文进化论的正确。例如，从低等生物到高等生物细胞色素C一级结构的比较中以及从脊椎动物血红蛋白一级结构的比较中绘制出的“进化树”，与分类学研究的结果完全相同。

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同源蛋白质一级结构的比较研究工作开展最多的是细胞色素C。细胞色素C是从微生物到植物、动物以及人体都具有的一种最古老的蛋白质，是传递电子的载体。脊椎动物的细胞色素C由104个氨基酸残基组成，昆虫类的细胞色素C由108个氨基酸残基组成，植物的细胞色素C则有112个氨基酸残基，所有生物的细胞色素C都含有一个辅基—血红素。比较不同生物的细胞色素C的一级结构发现有35个氨基酸残基是完全不变的，这35个氨基酸残基正是完成细胞色素C的生物学功能必不可少的。这就是说，虽然生物不断进化，但只要细胞色素C仍然担负着传递电子的作用，那么，为了完成这一功能所必须的氨基酸就始终不会改变。

比较目前研究过的近百种生物的细胞色素C的氨基酸顺序，我们可以看出差异的大少与亲缘关系密切相关。如下表：

各种有机体细胞色素C中氨基酸顺序的差异

氨基酸顺序 氨基酸顺序 相互比较生物种类 相互比较的生物种类 中差异的数目 中差异的数目 人—黑猩猩 0 哺乳动物内部 平均5.1 人—恒河猴 1 猪—牛—羊 0 人—其它哺乳动物 平均约10 马—牛 3 人—禽类 平均约13 哺乳动物—禽类 平均9.9 人—昆虫 平均约30 哺乳动物—爬虫类 平均14.3 人—植物 平均约40 陆生脊椎动物—鱼类 平均18.5 人—微生物 平均约50 脊椎动物-无脊椎动物 平均26.0

同源蛋白质分子中氨基酸排列顺序的种属差异部分系生物进化过程中基因突变的结果。如果基因突变导致蛋白质一级结构改变，但不影响功能，这种蛋白质就被保留下来，这正是同源蛋白质种属差异的原因。

分子进化研究是随着蛋白质一级结构的研究发展起来的一个课题。我们知道生物均由古生物进化而来，也就是说任何生物都有其祖先，那么，蛋白质是否也有祖先蛋白的问题呢？从对几种不同蛋白质一级结构相似性的分析，可以说祖先蛋白的概念是成立的。例如，丝氨酸蛋白水解酶与胰蛋白酶、糜蛋白酶A、弹性蛋白酶以及凝血酶原的氨基酸顺序极其相似，虽然它们的祖先蛋白质的结构还不清楚，但是人们认为这些蛋白质是来自于一个共同的祖先。再如，动物的肌红蛋白与血红蛋白的α、β链的一级结构和三级结构是非常相似的，甚至植物的豆血红蛋白的结构也与它们很相似，这是因为它们有共同的祖先。它们是由同一祖先（珠蛋白）的基因发生变异形成的。又如，含有51个氨基酸残基的胰岛素是由84个氨基酸残基的的胰岛素原经酶作用切去C链后生成。而神经生长因子（NGF）是由118个氨基酸残基组成的，它与胰岛素的一级结构极其相似，因此可以认为胰岛素与神经生长因子均由祖先蛋白胰岛素原进化而来。这种从一个共同祖先蛋白质发展出另一种新蛋白质的现象称为分叉进化。分叉进化形成的两种不同蛋白质都保留着过去历史的痕迹，反映在氨基酸顺序上就有相同之处。因此，蛋白质一级结构的研究是推动分子进化研究的一个重要方面。

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(二)、一级结构与功能的关系

蛋白质的氨基酸顺序与生物功能具的密切的关系，特别是蛋白质与其它生物大分子物质之间的相互作用及其作用方式都是由氨基酸顺序决定的。例如：

1． 细胞膜上的血型糖蛋白的一级结构就与膜结构有着重要关系。血型糖蛋白的分子量为31000，含糖量为60%，由131个氨基酸残基组成，它的分子中含有16条寡聚糖链。血型糖蛋白分子一部分位于细胞外面，为N—末端部分，含有糖残基，是亲水的肽段；中间的一部分跨过细胞膜 ，这部分是由疏水氨基酸组成的；还有一部分位于细胞的内部，也是亲水的肽段。这三部分氨基酸顺序不同，分别与它们的功能有关。细胞外的部分含有寡聚糖链，与细胞的识别有关，血型糖蛋白的跨膜部分由疏1—73膜外74—95跨膜水氨基酸组成，故与生物膜的脂质双层能以疏96--131膜内 代表寡聚糖链 水作用力结合在一起。细胞内的部分由于是亲水的，故能溶于细胞质中。 2．蛋白质与核酸的结合也与蛋白质的氨基 血型糖蛋白的跨膜结构示意图 酸顺序有密切的关系。 例如，真核细胞染色体 DNA 与组蛋白相结合,作用力是蛋白质分子中氨 基酸残基上的正电荷与 DNA 分子中磷酸基上的 1+ + + + + 36 129

负电荷之间的静电引力.小牛组蛋白含有129个 - - - - - - DNA 氨基酸残基。 在前36个氨基酸中有12个带正

电荷(如Lys、Arg等)，而不含负电荷氨基酸。 小牛组蛋白与DNA结合状态示意图 因此，这部分肽段能与 DNA双螺旋中带负电荷

的磷酸基团通过静电引力相结合，而其它部分则折迭成球状。

3．有些激素是简单的多肽，它们各自具有特殊的功能，大多数的结构也已研究清楚，我们可以通过比较来了解肽链一级结构与功能的关系。例如，牛的催产素和抗利尿素的结构相似，都是环八肽，但有两个氨基酸不同。结构如下：

S S

甘—精—脯—半胱—天冬酰胺—谷氨酰胺—苯丙—酪—半胱

（牛抗利尿素）

S S

甘—亮—脯—半胱—天冬酰胺—谷氨酰胺—异亮—酪—半胱

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（牛催产素）

由于结构相似，两者在生理功能上也有相似之处，但活性差别很大。催产素主要是促进子宫收缩的催产作用，但同时也具有微弱的抗利尿活性；抗利尿素的主要作用是抗利尿和增血压，但也具有微弱的催产活性。这说明由于结构相似也引起功能上互有另一种激素的微弱活性；同时也说明只要结构有差异，那怕是相差一两个氨基酸，其生物学活性就有较大的差别。

4．蛋白质一级结构改变，往往会导致功能的改变。例如，正常人血红蛋白β链从N—端开始第6位氨基酸是谷氨酸，当此氨基酸被缬氨酸取代时，将导致镰刀型贫血病。谷氨酸的侧链是带有负电荷的亲水羧基，而缬氨酸的侧链是不带电荷的疏水基团。当谷氨酸被缬氨酸取代后使Hb的表面电荷性质发生了改变，于是等电点改变，溶解度降低和不正常聚合增加，以致红细胞收缩变形而成为镰刀状，且输氧能力下降，细胞脆弱，容易溶血，严重的可导致死亡。就正是我们所说的分子病中的一种，是由于基因突变引起的，具有遗传性。

5．在动物体内的某些生化过程中，蛋白质分子的肽链必须先按特定的方式断裂，然后才呈现生物活性。蛋白质分子的这一特性具有重要的生物学意义。这是蛋白质分子结构与功能具有高度统一性的表现。例如，在酶的调控中，早就发现，许多酶有一个无活性的前体，经专一的酶（或其它物质）作用切去一段肽链后，才成为有活性的酶（如胃肠道中的几种蛋白酶及血液中的凝血酶等）。再如，血液凝固过程中，纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程。纤维蛋白原是无活性的前体，呈细长的纤维状，由6条肽链组成，2条Aα链，2条Bβ链，2条γ链，所以可表示为（AαBβγ）2。血液凝固过程中，在凝血酶的作用下，分别从Aα链和Bβ链的N—端水解下来4个肽段，即2个A肽和2个B肽。A肽为19肽，B肽为21肽。从一级结构上讲，它们都含有较多的酸性氨基酸。当切除A、B肽后，使蛋白质分子的负电荷减少，促进了纤维蛋白分子的聚合，进而在凝血因子的作用下，形成网状结构的纤维蛋白，使血液凝固。其过程如下：

2A+2B(血液纤维蛋白肽) 凝血酶 (AαBβγ)2 自发聚合 交联作用 纤维蛋白原 (αβγ)2 [(αβγ)2]n {[(αβγ)2]n}m 转谷氨酰胺酶

纤维蛋白单体 纤维蛋白多聚体 纤维蛋白

近年来发现许多肽类激素也都存在着前体。例如，胰岛素的前体—胰岛素原是由84个氨基酸残基组成的一条长链，即在胰岛素和A、B两链之间连接着一段由30多个氨基酸组成的C链。经专一的酶水解切除C链后，才形成通过二硫键使A、B两链相连的活性胰岛素。

蛋白质在初合成或分泌运输阶段或贮存阶段是无活性的前体，在到达其发挥作用的部位或在需要其发挥作用时，才转变成有生理功能的蛋白质，这是生物体内一

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种十分巧妙的调控过程。

从上面几个问题人们可以清楚地看到，蛋白质一级结构的研究对阐明生命现象的本质是非常重要的。

(三)、从蛋白质一级结构预测其二、三级结构

研究蛋白质一级结构的一个重要目的是利用氨基酸顺序的资料预测蛋白质的二级以至三级结构，甚至还可以预测蛋白质的某些功能。因为蛋白质一级结构包含着蛋白质分子的所有结构信息，我们可以利用这些信息预测出蛋白质的空间结构。许多科学家在这方面已做了不少工作。例如，1975年利维特（Levitt）和沃谢尔（Warshel）从胰蛋白质抑制剂的氨基酸顺序之间的热力学相互作用数据（最小能量和热能化）模拟了该蛋白质的折迭结构，其结果与X—射线衍射的结果有相当好的一致性。1979年仇（Chou）和费思曼（Fasman）根据蛋白质中氨基酸残基形成α—螺旋、β—折迭或β—转角的倾向，预测了由一级结构折迭成二级结构、超二级结构构象，也得到了很好的结果。1982年索尔（Sauer）等人曾经指出：“顺序的同源性反应出结构的同源性。”这是很有意义的概念。现在，人们已经能够利用微电脑来研究蛋白质的分子构象。英国成立了生物化学微电脑组织，我们可以相信，随着电子计算机在生物化学中的广泛应用，今后这方面的进展将会更加神速。

第二节 蛋白质的二级结构

蛋白质二级结构是指多肽链主链上局部原子的空间排列状态。二级结构是靠肽链中 >N—H与 >C＝O之间所形成的氢键而得到稳定的。所以二级结构只涉及肽链主链的局部原子及其链内的氢键，而不涉及侧链构象和与其它肽段之间的关系。

一、 肽键

在蛋白质分子中氨基酸靠肽键连接成多肽。肽键的结构如下： 波林（Pauling）和 莫曼奈（Momany）分别 于1951年和1975年测定了肽的键长和键角。发 H Cα 现肽键（即C′—N）的长度为0.133nm (1.33A)。 N C′ 而正常的C—N键长为0.149 nm (1.49A)，C=N Cα O 键长为0.127nm (1.27A)。可见,肽键的长度介于

单健和双键之间。并且C＝Ｏ比正常的醛或酮中的C＝Ｏ长了0.0012nm (0.012A)，Pauling解释这个现象是由于下列两个极端结构（Ⅰ和Ⅱ）之间的共振引起的。 Cα H Cα H +

C′ N C′ N

- O Cα O Cα Ⅰ Ⅱ

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o

o

o

o

Cα H C′ N O Cα Ⅲ

肽键的实际结构是一个共振杂化体（如结构Ⅲ），这是介于结构Ⅰ和结构Ⅱ的中间状态，可以看作是结构Ⅰ和结构Ⅱ的“杂交结构”（ 结构Ⅰ和结构Ⅱ的比例为3:2）。肽键的C—N单键有40%的双键性质，肽键中C=N双键有40%的单键性质，因此，肽键具有部分双键的性质（约40%），不能自由旋转，所以肽键是一个刚性平面，称为肽平面（酰胺平面）。结构Ⅲ中的6个原子差不多处于同一平面内。在肽平面内，两个Cα处于顺式构型或反式构型。在反式构型中，两个Cα原子及其取代基团相互远离，而顺式构型中它们彼此接近，引起Cα上R之间的空间位阻。所以反式构型比顺式构型稳定，但也有例外，如脯氨酸的肽键是反式的，也可以是顺式的，因为四氢吡啶环引起的空间位阻消去了反式构型的优势。 二、 多肽链的折叠

前面已经讲过，肽健实际上是一个共振杂化体，形成刚性的肽平面。肽平面是肽链上的重复单位，称为肽单位或肽基。肽链主链的构象可以用“二面角”来描述。两个肽平面由Cα的四面体键相连接。Cα—N1键和Cα—C2键都有是单键，所以相邻的两个肽平面可分别绕Cα—N1键和Cα—C2键旋转。绕Cα—N1键旋转的角度称φ（psi角），绕Cα—C2键旋转的角度称ψ（phi角）。原则上φ和ψ可以取-180°-- +180°之间的任一值。

当φ的旋转键N1—Cα两侧的N1—C1

和Cα—C2呈顺式时，规定φ=0°;同样， ψ 的旋转键Cα—C2 两侧的Cα—N1 和 C2—N2呈顺式时,规定ψ=0°。从Cα向 N1看，沿顺时针方向旋转Cα—N1键形成 的φ角度规定为正值， 反时针旋转为负

值；从Cα 向C2 看， 沿顺时针旋转 Cα 完全伸展的肽链构象(φ=180°ψ=180°) —C2键所形成的ψ角度规定为正值，反时针旋转为负值。

虽然φ和ψ可以在-180°-- +180°范围内自由旋转，但并不是任意二面角所决定的肽键构象都是立体化学所允许的。例如，当φ=0°、ψ=0°时的构象不可能存在。因为两个相邻平面上的酰胺基H原子和羧基O原子的接触距离比其范德华半径之和小，因此将发生空间位阻。二面角所决定的构象能否存在，主要取决于

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相邻肽单位中非键合原子之间接近时有无阻碍（或者说能量是否达到最低）。

Ramachandran（拉姆陈德莱）等到人在1963年研究多肽链的立体化学时，对这一复杂问题作了近似的处理。

Ramachandran等人将原子看作简单的硬球，根据范德华半径可以确定非键合原子之间的最小接触距离。

非键合原子范德华半径距离与最小接触距离（A）

H 2．40 C （2．20） 2．40 N （2．20） 2．40 O （2．20） 2．20 H （1．90） （上行为Van der Waals半径距离，下行带括号的数据为Ramachandran测得的非键合原子的最小接触距离）

Ramachandran根据非键合原子之间的最小接触距离，确定哪些二面角（φ、ψ）决定的相邻的二肽单位的构象是立体化学允许的，哪些是不允许的。用φ对ψ作图，得到φψ图（φψmap），或者称为Ramachandran图。

Ramachandran等人将13种球蛋白的2500个残基的主链的二面角作出分布图。在分布图中有两个最密集的区域。一个的最大密度接近（-60°， -60°），它反映球蛋白的右手α—螺旋的位置，另一个的最大密度位于（-60°， +120°），相当于β—折叠的区域。

在Ramachandran图上表现出了“允许区”、“最大允许区（临界限制区）”和“不允许区”。实线封闭区为允许区，在此区域内任何二面角所决定的肽链构象都是立体化学允许的。因为在此肽链构象中，非键合原子之间的距离不小于标准接触距离，二者之间没有斥力，构象的能量最低，所以这种构象是最稳定的。位于允许区的有α—螺旋、平行β—折叠、反平行β—折叠及胶原螺旋。虚线以内的区域为部分允许区，在此区域内φψ所决定的肽链构象也是立体化学允许的，但是不够稳定。如310螺旋、π—螺旋及αL—螺旋等。虚线以外的区域为不允许区，因为在这些肽链的构象中，非键合原子之间的距离小于极限值（比标准接触距离小0.1—0.2 A），二者产生很大的斥力,构象的的能量很高。例如：当φ=0°，ψ=180°时两个肽链平面上的羧基氧原子之间的距离太近， 是不允许的。 当φ=180°，ψ=0°时，两个肽链平面上的氢原子之间的距离太近，也是立体化学所不允许的。

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o

o

C 3．20 （3．00） N 2．90 （2．80） 2．70 （2．60） O 2．80 （2．70） 2．70 （2．60） 2．70 （2．60）

Ramachandran构象图

C=胶原螺旋；β=反平行β—折叠；βP=平行β—折叠；αR=右手α—螺旋； αL=左手α--螺旋；310=310螺旋；π=4.416螺旋。

由于上述原因，使肽链的折叠具有相当大的局限性，肽链的折叠只能以不发生空间障碍为标准，形成若干允许构象。但值得一提的是甘氨酸和天冬酰胺偏离允许构象很远。甘氨酸缺乏侧链的制约，常以此满足肽链急剧转折的需要，这是允许的，也是可以理解的；但天冬酰胺为何有此表现，至今未得到圆满的解释。

如果肽链规则折叠，在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，也就是具有相同的（φψ）角，这时肽链就构成一种线性组合，形成二级结构。目前已肯定下来的二级结构主要有以下几种：α—螺旋、β—折叠、三股胶原螺旋、回折结构、310螺旋、π—螺旋等。 三、 α—螺旋

α—螺旋是人们首先肯定的一种蛋白质空间结构形式，也是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。20—30年代，X--射线衍射技术创始人布拉格(W.L.Bragg)创立了一个强有力的学派，他们一方面利用这一技术去测定无机分子的结构，同时对生命物质也表现出了极强的兴趣。这个学派的代表人物如阿斯特伯瑞(Astbury)、贝尔纳（Bernal）、克鲁福特（Croufoot）等，从30年代开始对蛋白质和核酸的X—射线衍射进行了大量的研究。Astbury首先获得了毛发纤维的衍射照片，并且发现拉伸的毛发和不拉伸的毛发衍射图样不同。这两种衍射图样代表了两种不同的空间结构，他提出不拉伸的称α结构，拉伸的称为β结构，并肯定前者比后者的结构更致密。到1951年，波林（Pauling）和科里（Correy）提出

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了α—螺旋和β—折叠。α—螺旋和β—折叠就是Astbury的α结构和β结构。衍射实验和以后大量的事实证明，α—螺旋的确是广泛存在于蛋白质中的一种基本的二级结构。

α—螺旋的特征是：①肽链中的肽键平面绕Cα相继旋转一定的角度形成α—螺旋，并沿中心轴盘曲前进。②螺旋上升时，每个氨基酸残基围绕中心轴盘旋100°(360/3.6)，二面角分别为：φ=-65°，ψ=-41°。③螺旋每绕一圈（360°）经过3.6个氨基酸残基(肽单位)，每个重复单位沿中心轴上升，0.15nm(1.5 A),螺距为0.54nm(0.15*3.6=0.54)(5.4 A)。五圈螺旋形成一个周期，含18个氨基酸残基，周期长为2.665nm(26.65 A)。④肽链中的全部 >C＝O和 >N—H几乎都平行于螺旋轴，每个氨基酸残基的>N—H与前面第四个残基上的 >C＝O靠近而形成氢键。即借氢键闭合为环，此环的原子数目为13

个原子。⑤所有的氨基酸测链

均伸向螺旋的外侧。⑥酰胺基

的3个原子N、C、O与螺旋轴

的距离分别等于0.157、0.161、

r o 0.176nm(1.57、1.61、1.76 A),此

0.54nm 0.15nm 距离仅比范德华半径小0.01nm o r=0.23nm (0.01 A),因此可以认为α—螺

旋是具有原子密堆积的结构，

中心腔附近没有空腔。这是它

稳定的一个重要因素。

任何一个螺旋结构都可以用3个符号S.m.R(或l)来表示。S代表螺旋每旋转一圈的氨基酸残基数，m代表由氢键连接形成的闭合环中的原子数目，R或L代珍右手或左手。因此，一个螺旋可表示为SmR或SmL。如右手α—螺旋可表示为3.613R，左手α—螺旋则为3.613L。

以α—螺旋作为基本结构的最典型实例是毛发的α—角蛋白。毛发是一种坚韧的纤维，α—螺旋作为它的基本结构单位，就好象棉纱和绳子之间的关系一样。这里有复杂的结构组织，一些细节还不能十分肯定。其基本景象如下：首先，三股右手α—螺旋向左缠绕，拧成原纤维（在这个过程中，α—螺旋沿轴线有相应的倾斜，重复距离从0.54nm缩短到0.51nm），直径为2.0nm。原纤维纵向穿过毛发。然后，9股原纤维排列成一个圆圈，围绕着另2股原纤维，构成“9+2”的电缆式结构，称为微纤维，直径为8nm。这种“9+2”的结构在其它蛋白质中也曾发现过。微纤维被包埋在含硫量很高的无定形基

质中。成百根这样的微纤维又结合成不 规则的纤维束， 称为粗纤维， 直径为

o

oo 23

200nm。 一根典型的羊发纤维横截面直 径为20μm，由直径大约为2μm的细胞

堆积而成。在这些细胞中粗纤维沿轴纵 向排列。所以一根看似简单的毛发，具 有高度有序的结构（α—螺旋→原纤维 →微纤维→粗纤维→细胞→毛发纤维）。 毛发的性能就决定于α—螺旋以及这样 的组织方式。α—角蛋白有非常好的伸 缩性，一根毛发可以拉长到原来长度的 2倍,这时α—螺旋被撑开,各圈间的氢 键被破坏，过渡为β结构。当张力去除 后，氢键本身并不足以使纤维返回到原 来的状态。但螺旋是被包埋在基质中的， 螺旋中的半胱氨酸与基质中的半胱氨酸 之间是以众多的二硫键交联起来的。一 般认为每四圈就有一个交联。这种交联 既可抵抗张力，又形成了外力去除后使 纤维复原的恢复力。结构的稳定性主要 是由这些二硫键保证的。从任何意义上 讲，毛发都不是一个活泼的或活性很高 的蛋白质，但它仍具有这样复杂的结构， 而且分子的性能直接决定于分子的结构 及其特殊的组织方式。

根据含硫量的大小，α—角蛋白可 以分成“硬型”角蛋白和“软型”角蛋 白两种类型。蹄、爪、角、甲中的角蛋 白是高硫硬型角蛋白，质地硬，难拉伸。 皮肤和胼胝组织中的角蛋白属于软型角 蛋白，它的伸缩性比前者好。同时，α —角蛋白也具有很好的抗挠性，这也与 二硫键的交联有很大的关系。如果没有

二硫键的交联，在突然碰到外力的情况 头发（B）和头发角蛋白（A）的结构 下，α—螺旋就会断裂，而且彼此错开散乱起来。这样即使外力去除，也不能恢原。 四、 β—折叠

早在20—30年代人们就设想，在蛋白质中存在一种近乎完全伸展的肽链构象。直到50年代初，人们才认识到，由于侧链之间的范德华斥力使这种完全伸展的肽

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链构象不可能存在，当然多聚甘氨酸除外。1951年Pauling和Corey提出一种稍有折叠肽链构象，称为β—折叠层。以后证实，这又是一种广泛存在于蛋白质分子中的二级结构。

β—折叠层的结构特征为：①多肽链取锯齿状折叠构象，酰胺基的取向使相邻的Cα为侧链腾出了空间，从而避免了任何空间障碍。②在这种构象中Cα—Cβ键几乎垂直于折叠层平面，使相邻的侧链交替的分布在层的两侧而远离折叠层。③β—折叠为两股平行或多股平行，分为平行折叠层和反平行折叠层。如果相邻两股链的方向相同，为平行β—折叠；如果相邻两股链的方向相反，则为反平行β—折叠。反平行β—折叠在纤维轴上的重复距离等于0.7nm(7.0A),而平行β—折叠在纤维轴上的重复距离则为0.65nm(6.5A)。在纤维蛋白中, β—折叠层主要取反平行方式。在球蛋白中，反平行和平行β—折叠均广泛存在。④在β—折叠的两个肽段之间，>Ｃ＝Ｏ和 >Ｎ－Ｈ形成氢健，这是稳定β—折叠层的主要力量。

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o

⑤β—折叠有的是平面的，有

的是非平面的。大多数球蛋白中的 0.7 nm β—折叠是非平面的，具有右手的 扭曲，这种扭曲有利于围绕α—螺 旋紧紧地组装起来。扭曲的右手β —折叠也可能与生物大分子间的相 互作用有关，如象扭曲的六股右手

β—折叠适合DNA螺旋的大沟，而 反平行β—折叠

扭曲的两股反平行β—折叠则适合 ( 代表羰基氧, 代表酰胺基氢, 代表R基) DNA或RNA的小沟。因此，扭曲的

β—折叠结构可能在蛋白质与DNA（或RNA）相互作用中有着重要的意义。

丝蛋白是具有β—折叠层结构的典型代表。Marsh于1955年提出丝蛋白分子的结构模型，在此结构模型中，反平行的β—折叠片再以平行的方式堆积起来形成多层结构，链间以氢键连接，层间主要以范德华力维系。将丝水解后的化学顺序研究表明，在丝的多肽链中有一种基本的六残基单位在长距离范围内重复。这个基本单位是（Gly—Ser—Gly—Ala—Gly—Ala）（Gly为甘氨酸、Ser为丝氨酸、nAla为丙氨酸），这是丝的独特氨基酸组成。这意味着Gly位于β层的同一侧，而所有的Ser和Ala则位于β层的另一侧。在多肽链中，两个残基的重复距离为0.7nm

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（7.0 A），反平行链间的距离为0.472nm(4.72 A）。许多这样的β—折叠片按Gly对Gly、Ala（或Ser）对Ala（或Ser）的方式堆积起来，这种交替堆积层之间的距离分别是0.35nm(3.5 A)和0.57nm(5.7 A）。结构中相邻的Gly取代片层表面或Ala（或Ser）取代片层表面彼此联锁起来。这样一种结构方式使得丝所承担的张力并不直接放在多肽链的共价键上，因而使这种纤维具有非常高的强度，但它没有多少延伸性，因为肽链已经在不断裂氢键的前提下处于相当伸展的状态。不过，由

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于堆积层是由非键合侧链原子间的范德华力维系的，又使得丝具有十分柔软的特性。

0.35nm

0.57nm

0.35nm

0.57nm

丝心蛋白的β—折叠层堆积方式（ 代表Ala或Ser、 代表Gly） 五、 胶原螺旋

胶原是广泛存在于动物体内的重要纤维蛋白，它具有十分独特的结构形式，是由三股平行而伸展的左手螺旋按右手方向拧成的超螺旋。即形成胶原的单股链为左手螺旋，再由三股这样的左手螺旋平行排列拧成一右手螺旋，所以是一个螺旋的螺旋。每条左手螺旋的螺距为0.95nm，相邻两个氨基酸之间的距离为0.29nm，每旋转一圈需要经过3.3个氨基酸残基。右手三股螺旋的螺距为1.04nm，每旋转一圈需要经过36个氨基酸。氨基酸顺序分析表明，胶原肽链的96%遵守 （Gly—X—Y），Y常为Hyp（羟脯氨酸）n的三联体重复顺序。X常为Pro（脯氨酸）或Hyl（羟赖氨酸）。Hyp和Hyl在其它蛋白质很少发现，它们是由相应的Pro（脯氨酸）和Lys（赖氨酸）在翻译后经羟化修饰转变而来。稳定三股螺旋的主要作用力一是链间的范德华力；二是三联体之间的氢键；三是三联体之间的共价交联键。（Gly—X—Y）n的三联体重复顺序是稳定三股螺旋必不可少的条件。因为单股螺旋在形成超螺旋的过程中，大约每三个氨基酸残基中就有一个必须与超螺旋的中心轴靠近。只有在轴上没有侧链出现，才能得到致密的有氢键键合的稳定结构。只有Gly符合这个条件。因为它的侧链位置只有一个H原子。这也就解释了为什么胶原螺旋中遵守着（Gly—X—Y）n的氨基酸排列顺序。氢键主要在一条链Gly上的 >N—H与另一条链X上的 >C＝O之间形成。链间的共价交联主要在赖氨酸或羟赖氨酸残基之间形成。X和Y残基的侧链均伸向超螺旋的外侧，所以胶原螺旋的外表有突起。

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胶原纤维中原胶原蛋白分子的排列方式

胶原螺旋是胶原纤维的基本结构。三股胶原螺旋又叫做原胶原，原胶原分子定向排列聚合为胶原微纤维，胶原微纤维再聚合并参入糖蛋白形成胶原小纤维，后者再进一步聚合为胶原纤维（胶原蛋白）。胶原蛋白是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，属于结构蛋白，主要存在于骨胳、肌腱、软骨、皮肤以及血管等组织中。由于胶原纤维是由这样一种伸展的多肽链组成，所以具有

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很强的机械强度。例如，肌腱中的胶原纤维的抗张力强度约为20—30Kg/mm，相当于12号冷拉铜丝的拉力。

六、回折结构

近年来，在球蛋白中发现了另一种广泛存在的二级结构，即180°的转折，称之为回折，它是α—螺旋、β—折叠的连接结构。在球蛋白中回折是非常多的，可占到氨基酸残基数的四分之一。回折结构主要由亲水氨基酸残基组成，大多数存在于蛋白质的表面，以满足肽链转折的需要。在球蛋白中通常有两种回折结构，即β—转角和γ—转角。

1．β—转角 β—转角由4个氨基酸组成，第一个氨基酸残基的 >C＝O与第四个氨基酸残基的 >N—H之间形成氢键。

2．γ—转角 γ—转角由3个氨基酸残基组成，第一个氨基酸残基的 >N—H与第三个氨基酸残基的 >C＝O之间形成氢健，第一个氨基酸残基的 >C＝O与第三个氨基酸残基的 >N—H之间也形成氢键。

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β—转角的两种类型

七、 310螺旋（γ—螺旋）

这种螺旋每旋转一圈需要经过3个氨基酸残基，靠氢键形成的环由10个原子组成，螺旋的半径为0.2nm。310螺旋比较稀少，球蛋白中有时仅有一小段存在于α—螺旋末端的旋转中。

八、π—螺旋

π—螺旋每旋转一圈需要经过4.4个氨基酸残基，每个氨基酸残基沿螺旋轴上升0.11nm，螺旋的半径为0.28nm，靠氢键闭合成的环中有16个原子，故可表示为4.416螺旋。

此外，还有δ—螺旋，它和π—螺旋相似，为4.314L螺旋。

第三节 超二级结构与结构域

人们发现在蛋白质结构中有一些二级结构的组合物，充当三级结构的构件。1973年Rossman称之为超二级结构，1976年利维特（Levitt）和乔纱尔（Chothia）又称它们为折叠单元。在蛋白质结构中超二级结构比二级结构在更高一级水平上代表了蛋白质的折叠单位。超二级结构非常适合多肽链的折叠，所以在蛋白质结构中经常存在。但人们对超二级结构研究的历史还不常，积累的资料还不够多，有待进一步深入探讨。目前已发现的超二级结构有以下五种。 一、 卷曲的卷曲α—螺旋（线圈的线圈α—螺旋）

1953年Crick提出的卷曲的卷曲α—螺旋是纤维蛋白中最常见的规则形式，在个别球蛋白中也已发现了这种结构 形式。其特征是两股（或三股）右手 α—螺旋彼此沿一个轴缠绕在一起， 形成一个左手的超螺旋，两股右手α —螺旋之间的作用角大约为18°,超 螺旋的重复距离为14nm.这种结构就

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好象两根弹簧向左手方向扭在一起一 样。在球蛋白中，常常是两段这样的 超螺旋相互靠近，形成四股α—螺旋 的左手扭曲，每股螺旋和其它螺旋之 间的夹角都是18°左右,有人将其称 为“4--α—螺旋束”。 4—α—螺旋束 二、 βξβ单元（β—片—β单元）

在多肽链的两股平行β—折叠中间以ξ连接起来，称为βξβ单元。在βξβ单元中，如果中间的连接为不规则的卷曲，就称之为βcβ单元；如果中间的连接是α—螺旋，就称为βαβ单元；如果中间连接为另一β结构，则称为βββ单元。在蛋白质中存在的βξβ单元的数量是比较多的。

蛋白质中常常还有两组βαβ组合成的一种更为复杂的超二级结构，这种结构称为Rossman折叠，它包括两个相邻的βαβ单元，即βαβαβ，有时还有ββααββ结构，这是βξβ单元的特殊形式。例如，在乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶以及丙酮酸激酶等蛋白质中都有典型的Rossman折叠—βαβαβ，在乳酸脱氢酶的结构域 2中有ββααββ形式的Rossman折叠片。

βαβ单元 βcβ单元 βββ单元

三、 β—迂回

在蛋白质中有些β—折叠层是由3个或更多相邻的反平行β—折叠形成，它们中间以短链（大多数为β—转角）连接。1980年斯查尔（Schulz）称之为β—迂回。β—迂回也是蛋白质结构中比较常见的超二级结构。β—迂回又有多种，典型的有β—曲折和回形拓扑结构。

β—曲折 回形拓扑结构Ⅰ 回形拓扑结构Ⅱ

[希腊钥匙结构（Greek Key）] [双希腊钥匙结构（double Greek Key）]

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四、 β—折叠桶

蛋白质中的β—折叠层可以进一步折叠成桶状结构，1982年理查德森（Richandson）将其称为β—折叠桶，简称β—桶。

β—折叠桶由β—折叠片形成。一条长的反平行的β—折叠片全部地或部分地卷成一个桶状。但更多的β—折叠桶是由数个平行或反平行的β—折叠片组成的，少的时候可以是5个，多的时候可达到15个之多。例如，葡萄球菌核酸酶的β—桶由5个β—折叠片组成，免疫球蛋白（IgG）恒定区的β—折叠桶含有7个β—折叠片，超氧化物歧化酶的β—折叠桶由8个β—折叠片组成。β—折叠桶的中心是疏水氨基酸的侧链，而亲水氨基酸的侧链伸向外周。

Richandson将β—折叠桶的结构分为三类。

1．印地安花蓝结构 主要由β—曲折进一步折叠形成。木瓜蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂中存在着这种结构。

2．希腊钥匙结构 主要由希腊钥匙结构折叠形成。凝乳蛋白酶、超氧化物酶抑制剂等蛋白质存在着这种结构。

3．闪电结构 主要由βξβ单元进一步折叠形成。磷酸丙糖异构酶等蛋白质中存在着这种结构。

反平行β—折叠桶 平行β—折叠桶

五、 α—螺旋—转角—α—螺旋

在1982年索尔（Sauer）等人研究蛋白质与DNA相互作用时发现，噬菌体λ434和P22的阻遏蛋白与DNA分子操纵子相结合的部位的结构都是α—螺旋—转角—α—螺旋，他们认为这也是一种超二级 结构，这种结构在蛋白质与DNA的相互作用

中占有重要的地位，这可能是与DNA相结合 α—螺旋 的蛋白质的共同特性。据测定噬菌体 λ434 和P22的阻遏蛋白的氨基酸顺序基本相同， 特别是在具有α—螺旋—转角—α—螺旋的

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超二级结构的部位的氨基酸顺序完全相同。

所以，这种结构可能是许多与DNA结合的蛋 α—螺旋—转角—α—螺旋 白质的共同特点。

六、 结构域的概念

生物化学家很早就已经注意到在蛋白质分子中存在着球状的亚结构。1959年、1966年、1968年科学家们先后分别从免疫球蛋白、溶菌酶和木瓜蛋白酶等蛋白质分子中发现了这种结构，1973年温特劳弗尔（Wetlaufer）将蛋白质中的这种亚结构称为结构域，认为蛋白质三维结构中存在的这些易于鉴别的球状亚结构具有重要的功能。目前已在大量的球蛋白、酶及结构蛋白（如肌球蛋白）中发现了结构域。

IgG分子及其结构域

a.IgG分子，每个圆圈代表一个氨基酸。b.可变区及恒定区结构域

大多数蛋白质分子都分裂成几个结构域，每个结构域含有40—400个氨基酸残基，但常见的为100—200个氨基酸残基，相当于直径为2.5nm的小球。形成结构域的原因可能是将蛋白质分子分隔成几个部分，使折叠过程变得简单一些，使每个独立折叠单位变得小一些。现在由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序已经了解到，每个结构域是由相应的外显子编码而成的。

结构域可以从蛋白质分子的电子密度图上看出。在进行蛋白质的X—射线衍射并计算电子密度图的过程中可以观察到，许多蛋白质分子中含有彼此连接松散的球状部分，它们的轮廓显示出这些蛋白质好象是由两个或多个裂片组成的。

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目前，结构域的概念已被生物化学家普遍接受，在描述蛋白质结构时也普遍使用结构域这个名词。

结构域具有邻相关性，即在多肽链上离得比较近的氨基酸残基，在三维结构上离得也比较近，因而形成一个结构域，而哪些离得比较远的氨基酸残基在三维结构上可以形成另一个结构域。邻近相关性表明，一条多肽链的折叠行为好象一条绳子，手持绳子的一端，让另一端缓缓地落在地面上，在地面上所形成的绳子的折叠不是随意的，而是表现出邻近的部分折叠在一起，远离的部分彼此远离。绳子不是纠缠在一起的，而是提起绳子的一端很容易散开。根据这个原则，肽链不应当存在打结的结构，事实上在所有已知结构的蛋白质中都没有发现打结的结构。

酶分子的活性中心常常存在于两个结构域的交界面上，使各个结构域的功能集合起来，便于形成更特殊的分子，使之具有更特殊的功能。酶的构象变化是酶作用机理的一个重要部分，酶的构象变化就包括结构域的运动。1984年，生物化学家证明，当酶与底物结合时，酶的结构域之间的裂隙要开启或关闭。这实际上是结构域运动的结果。结构域的这种运动可使催化基团定向地包围底物，辩别出底物是否合适。结构域的运动已在柠檬酸合成酶、醇脱氢酶等许多酶分子中发现了。

蛋白质的构象变化与功能之间的关系被称为蛋白质动力学。目前，蛋白质动力学已经成为蛋白质化学或分子生物学的一个重要研究领域，它将对酶的作用机理、蛋白质的功能作出深入的、更进一步地解释，也将会使我们对生命现象的理解更加深入到分子水平。

第四节 蛋白质分子的三级结构

蛋白质分子的三级结构是指二级结构和非二级结构在空间进一步盘曲折叠，形成包括主、侧链原子在内的专一性三维排布。对单链蛋白质来说，三级结构就是分子特征性主体结构，对多链蛋白质来说，则是指各组成链的构象。所以，三级结构是蛋白质分子或蛋白质分子中亚基的所有原子在空间的排布，它不涉及与相邻分子或亚基间的相互关系。具有三级结构的蛋白质分子，都有近似球形或椭球形的物理外形，常称为球蛋白。它们虽然与纤维蛋白不同，但却含有构成纤维蛋白的许多二级结构，如α—螺旋、β—折叠，此外还有一些区段含有β—转角和不规则构象。 一、 球蛋白的折叠原则

迄今为至，已经确定的蛋白质结构有400多种，显示出了球蛋白的一些结构规律。虽然每一种不同氨基酸排列顺序的蛋白质总是具有一种独特的三级结构。但仔细比较就可以看出，许多蛋白在基本结构上具有某些相似之处，顺序和功能很少相似的蛋白质之间也有共同的结构特点。这些共同的结构特点说明有共同的物理原因。蛋白质的结构特点反映出了两种不同的物理效应。第一种是手性效应，

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即蛋白质中肽链的排列是的手性的，分为左手和右手，这是由于多肽链是由手性的L—氨基酸组成的。第二种效应是α—螺旋、β—折叠这样的二级结构怎样才能最有效地组装在一起，使蛋白质与溶液接触的表面积达到最小。这对三级结构的形成是非常重要的。下面我们简要的介绍这两种效应。

1． 手性效应对多肽链折叠的影响

根据蛋白质主要由手性的L—氨基酸组成的事实，从能量的计算上得知，多肽链最稳定的构象并不是直的，伸展的多肽链以稍向右手扭曲为好。这种扭曲的效应还可进一步使肽链以右手方式产生一个线圈。伸展的肽链扭曲的倾向使其构象在能量上达到最小。

伸展的多肽链右手扭曲的效应表现在以下两个结构特征上。第一个特征是在平行β—折叠末端的连接方向上。在反平行的β—折叠链之间可以以简单的发夹回转的方式在片层的同一端相连。但在平行β—折叠中，则要求在片层的不同端相连，从而形成交叉连接。这种连接可以是右手方向，也可以是左手方向。但实际上在蛋白质分子中观察到的交叉连接都是右手方向。这可能是因为右手交叉连接方式在能量上有利。第二个特征反映在球蛋白平行β—折叠片的几何学上。当

发夹连接 右手交叉连接 左手交叉连接

沿着肽链方向观察时，球蛋白的β—折叠片总是向右手方向扭曲。β—折叠片这种上扭曲行为是蛋白质结构上的一个重要特性，因为扭曲的β—折叠片往往能构成蛋白质结构的骨架。当然，平行β—折叠片的扭曲也不可能是无限制的，因为在扭曲过程中会遇到氢键的抵抗，即存在着扭曲力和氢键之间的竞争。所以，在几何学上往往形成“马鞍状”或“柱状β—桶”结构。

手性效应影响平行β—折叠的连接，也影响它的几何形状。按上述原则，平行β—折叠之间的交叉连接都有是右手的。所以，在平行β—折叠桶中，连接肽段不能深入到桶的中心，使桶的中心足以容纳疏水侧链。多肽链骨架以简单的右手旋转围绕着β—桶缠绕起来，一次移动一个 β—折叠片，而把α—螺旋围在外面。因此， 虽然这些结构较大，而折叠方式则很简单。在 马鞍β—折叠中，β—折叠片的每一侧有一层 α—螺旋，用右手交叉连接来完成这种结构， 多肽链必须有时沿一个方向移动，有时沿另一

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个方向移动。

在反平行β—折叠桶中，手性原则也影响

了桶的形状。β—折叠片之间的连接横穿桶的 马鞍形结构 顶部或底部，而不是直接连接到它的最邻近β

—片上。如果将反平行β—折叠桶展开放平，从溶剂的一侧观察，则β—折叠片呈回形拓扑结构。

2． 二级结构的有效组装

在蛋白质三级结构的形成过程中，另一个效应是如何有效地使二级结构组装成更大的单位，并使其与溶剂的接触面积最小。

首先必须肯定单层结构的蛋白质是不稳定的，因为在单层结构中会将疏水基团暴露在溶剂中。所以蛋白质至少需要两层才能把疏水基团掩盖起来，单层结构的蛋白质是不存在的。反平行β—折叠是典型的双层结构，即由两层β—折叠构成β—折叠桶。这样一来，使β—折叠片的一侧位于桶的内侧，这一侧包含了疏水侧链；另一侧位于桶的外侧，是亲水侧链，从而使疏水基团被有效的包裹在结构的内部而且远离溶剂，以便形成稳定的结构。也有一些反平行β—折叠蛋白质只有一层β—折叠片，但在其上面又覆盖了一层α—螺旋。平行β—折叠蛋白质至少有三层或者四层结构。因为平行β—折叠片之间必须由其它结构（如α—螺旋）交叉连接。β—折叠片总是在蛋白质的中心作为结构的骨架，外周则是另外的结构。最常见的组装之一就是一系列交叉连接的βαβ结构，这种方式的组装最终形成的结构可以看作是由β—折叠组成的内部桶又被α—螺旋组成的外部桶紧紧地包装起来，所以看上去是四层。我们曾经提到过的马鞍形结构则为三层，中间是一层扭曲的β—折叠片，两侧则是α—螺旋或其它结构。

反平行β—折叠片的装配

完全由α—螺旋作为二级结构的蛋白质也有一定的组装方式（如4—α—螺旋束）。总之，蛋白质在由二级结构装配成三级结构时，都必须有效地将氨基酸的疏水侧链包裹在分子的内部。为达到此目的，二级结构的组装必须紧凑，从而使其分子与溶剂的接触面积达到最小。

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平行β—折叠片的装配（A. β—折叠桶，B.马鞍形结构）

二、 稳定三级结构的主要作用力

蛋白质分子复杂的三级结构是由复杂的作用力体系来稳定的，而且具有与非生命物质分子极为不同的作用特征。从化学键的水平上来说，存在于蛋白质分子中的主要作用力包括：二硫键、氢键、疏水作用力、离子键和范德华引力。弱相互作用（非共价键）在蛋白质三级折叠中占有重要地位，这是蛋白质分子结构的一个重要特征。在这一水平上，蛋白质分子的主链与主链之间、侧链与侧链之间以及主链与侧链之间存在着错综复杂的相互作用，从而使蛋白质分子在三维水平上形成一个有机的整体。

1． 二硫键

二硫键是蛋白质分子中稳定三维结构的唯一共价键。二硫键在蛋白质分子中存在和作用的情况有很大的差别，一般说来，在由单链组成的小蛋白质分子（如核糖核酸酶、溶菌酶、胰蛋白酶和胰岛素等）中，这些键的比例很大，特别是胞外空间中的蛋白质中较多，如牛血清清蛋白中有7对，r—球蛋白中有16对（分子量分别为66500和160000）。但是许多蛋白质，特别是哪些多亚基蛋白质中却完全没有二硫键，如血红蛋白、胶原蛋白以及许多酶分子中都不含二硫键。

在含二硫键的蛋白质中，二硫键对三级结构的稳定性有很大的影响。二硫键的高含量可使蛋白质抵抗变性，并在二硫键不断裂的前提下，结构易于再生。因此，在局部变性的情况下，保留二硫键的片段重新折叠的概率大，这是含二硫键蛋白质的一般特征。这种付加的稳定性对于在胞外变化较大的环境中维持蛋白质的正常功能可能是很重要的。但是，大量的实验证明，直接影响多肽链三级折叠的是非共价键，而不是二硫键。这些实验和发现支持了这样一个观点：在多肽链折叠成最后稳定构象的过程中，二硫键并不起主要作用，但这种键可以补充和完善非共价键的作用，增加肽链三级折叠的稳定性。

2． 氢键

氢键是指连接着一个电负性原子（如N、O或S）的氢与另一电负性原子之间的相互作用，可表示为：X—H Y。这是一种类似于静电引力的相互作用力。一般

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来说，如果X和Y都是电负性较大、半径较小的原子（如F、N、O、S等），则在X—H Y之间都可以形成氢键。如肽链主链上的 >N—H O=C< 。

在蛋白质中含有许多可形成氢键的基团，所以有大量的氢键存在。一般说来，主链上的氢键比侧链基团形成的氢键多，前者更多地具有结构上的意义，后者在功能上常起着重要的作用。在蛋白质分子中存在着错综复杂的氢键网络，它们对于维持蛋白质的三级结构的完整性和功能的灵活性具有十分重要的意义。

氢键具有两个重要的特征，即方向性和饱和度。方向性是指氢的给供体原子以及氢一般都处于非常接近一条直线的位置上。饱和性是指一个X—H只能和一个Y原子形成氢键。在形成蛋白质三级结构时，在最大限度成氢键的原则下，这两个特征都起着重要的作用。但近年来在测定的蛋白质结构中，也发现有非直线的和分叉的氢键存在。

3． 疏水作用力

蛋白质分子中有许多非极性侧链或基团，这些非极性侧链或基团出自避开极性溶剂的需要而相互聚集的趋势称为疏水作用力。疏水作用力是一种能量效应，非极性基团相互聚集，以避开水或者说远离水，这在能量上是有利的。所以，蛋白质分子内非极性基团之间相互作用形成一个疏水“内核”，位于三级折叠的内部空间，而极性侧链或基团大多分布在三级折叠的表面，形成亲水区。这对蛋白质构象的稳定具有十分重要的意义。现在越来越多的人认为，远距离残基间的疏水作用对蛋白质的特征构象具有关键性的影响。对于一个普通组分的蛋白质来说，它的主链原子（N、Cα、C、O、H）和侧链第一个原子Cβ约占原子总数的67%，而它们在所有的蛋白质中都是相同的，显然，各种蛋白质分子的三维结构特征是由其余33%的侧链原子决定的，这充分表明了远距离铡链之间相互作用的重要性。

4． 离子键（盐键）

离子键是指带相反电荷的基团之间的静电吸引力。蛋白质分子中，这种吸引作用主要在荷负电的Asp、Glu（高pH条件下还有Cys的巯基和Tyr的酚基）侧链和荷正电的His、Lys、Arg侧链之间产生，当然末端羧基和质子化的氨基也可以参加这种作用。由于这里的荷电性能都是基团性的，在形式上和酸碱成盐类似，所以在蛋白质化学中，更常用的名称是“盐键”。蛋白质分子中的这些基团也都有成氢键的能力，当它们位于蛋白质结构的内部时，成氢键是更基本的形式，但在特定的表面位置或在配基结合位置上，这些荷电基团之间则形成离子键，从而对这些位置的构象和特征起着重要的作用。

5． 范德华引力

范德华力是指分子与分子或原子与原子之间接近到很短距离时才明显出现的一种静电相互作用。范德华力包括三种较弱的作用力，即定向效应、诱导效应和分散效应。定向效应发生在极性分子或基团之间，它是永久偶极间的静电相互作用。氢键也可以认为属于这种范德华力。诱导效应是发生在极性分子或基团与非极性分子与基团之间，这是永久偶极与由它诱导产生的偶极之间的相互作用。分散效应是在多数情况下起主要作用的范德华力，这是非极性分子或基团间存在的

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范德华力，也称之为London分散力。它是由于分子或基团中电子密度的波动（即电子运动的不对称性）而造成瞬时偶极，是这种瞬时偶极间的相互作用。偶极的方向也是瞬时变化的。

+ - + - + - + - + - 定向效应 诱导效应

分散效应

蛋白质分子的三级折叠具有专一性和可变性的辨证统一。由于共价键和大量的次级键的协同作用，维持了蛋白质分子三级折叠的专一性和稳定性。但由于单个次级作用是很弱的，它的破坏和改变极为容易。少数次级作用的破坏或改变将会引起构象上的一些变化，但并不影响蛋白质的总体结构和完整性。因此，次级作用就成为蛋白质三级结构可变性和灵活反应的基础。蛋白质的结构特征和功能表现是与其错综复杂的次级作用及其灵活的专一性变化密不可分的，蛋白质变性时，其共价结构基本保持不变，被破坏的主要是分子内的次级作用；蛋白质的变构也总是伴随着次级作用的变迁。所以，不论是研究蛋白质的结构，还是探讨其功能关系，都必须充分重视蛋白质分子内的这些重要特征。 三、 蛋白质三级折叠的形成

蛋白质三级折叠的形成的研究是目前一个十分活跃的领域。所谓蛋白质折叠是指一个新合成（或变性）多肽链的开放构象，总体转化为天然蛋白质特征的三级折叠的过程。近年来，关于蛋白质折叠的主要成就是肯定了折叠的自发性，证实蛋白质分子的特征三级折叠唯一地决定于它的氨基酸排列顺序。简单地说，一级结构决定了高级结构。关于肽链转换为三级折叠的方式、机理和过程的研究不少，但至今肯定下来的东西不多。对于蛋白质的折叠机理，目前比较流行的是随机成核理论。该理论认为，折叠为两个时相，第一时相的半成期为55毫秒，代表了蛋白质多肽链的随机成核；第二时相的半成期是350毫秒，代表了以这一核心为基础，完成其余部分的折叠。现在已提出了一种三阶段随机成核理论，按照这一理论，蛋白质分子折叠的第一阶段是成核，即小部分的肽链迅速形成α—螺旋、β—折叠等二级结构，这是进一步折叠的核心和基础。第二阶段是折卷，即已成核的结构，随后形成较大的部件（超二级结构）。这一阶段的折叠已粗略的近似于最后的结构，但在原子水平上还缺乏最后的凝聚。第三阶段是凝聚，即已形成的较大组合结构，最后在原子水平上凝聚，形成天然的致密结构。

第五节 蛋白质的四级结构

一、 基本概念

许多蛋白质作为一个活性单位时，系由两条以上的肽链组成的。这些肽链都有各自的一、二、三级结构，每个具有完整三级结构的单位称为亚基，通常一个亚基是一条肽链，但也存在由两条或多条肽链组成的亚基，亚基的聚合体称为寡

37

聚体（寡聚蛋白），寡聚体中亚基的数目、类型、亚基的立体排布、亚基间的相互作用与接触部位的布局均属于蛋白质四级结构研究的内容。所以，四级结构就是指蛋白质分子中亚基在空间排列状态、亚基间的相互作用以及接触部位的布局。一般说来，亚基单独存在时是没有生物学活性，只有聚合成完整的四级结构之后才具有生物学活性。在四级结构中亚基可以是相同的，也可以是不同的。例如，过氧化氢酶是由4个相同的亚基组成的，而血红蛋白则是由不同的α亚基和β亚基各一对聚合而成的。在寡聚蛋白质中，亚基与亚基之间主要以弱作用力相联结，有些蛋白质中也有二硫键。球蛋白聚合成四级结构可以形成一个更加复杂的蛋白质结构，以便执行更为复杂的功能。 二、 亚基的数目和种类的确定

确定蛋白质分子中亚基数目的方法通常是：先用超速离心法或凝胶过滤法测定天然寡聚体的分子量，然后用盐酸胍、脲等变性剂或其它方法使分子中的亚基相互分离，再测定亚基的分子量，由二者的比例来确定寡聚体中亚基的数目。例如，大肠杆菌β—半乳糖苷酶经超速离心法测定得知其分子量为540000；经SDS凝胶电泳法测定其亚基分子量为135000，二者的比值为4，说明该酶是由四个大小相同的亚基组成，是四聚体。再如，用Sephadex G—100凝胶过滤法测定出狗肝Cu、Zn—SOD分子量为33600，经SDS电泳法测定出其亚基的分子量为16845，二者成2倍关系，因此可以断定狗肝Cu、Zn—SOD是由两个大小相同的亚基组成。

确定亚基的种类的方法是：将天然蛋白质解离成亚基后，进行超速离心和肽结构分析，通过比较分析结果来确定蛋白质分子中亚基的种类。

到目前为止，使用上述方法已经发现大约有700多种蛋白质具有四级结构。其中酶就有500多种。 三、 亚基的排布

应用X—射线衍射技术和电子显微镜可以确定亚基的排布情况。亚基的排布多为对称型，主要有两种方式的对称。

1．循环对称（Cn） 又称环状点群对称，这是最简单的排布方式，亚基按圆周周方式对称分布。例如，电子显微镜观察发现丙酮酸羧化酶和色氨酸酶均为C4对称，即排布在正四方形的各个角上。精氨酸脱羧酶为五聚体，亚基排布于五角形的各角上，属C5对称。

C2线形 C3正三角形 C4正方形 C5正五角形

2．二面体对称（Dn） 又称二面体点群对称。例如，异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶，血红蛋白都有是四聚体，它们的亚基呈正四面体分布，即分布在正四面

38

体的四个角上，属D2对称排布；谷氨酰胺合成酶为12聚体，各个亚基位于六角锥体的各个顶点，属于D6 对称排布。

蛋白质的亚基数多为偶数，有2、4、 6、8、12、24 ···2130（烟草斑纹病毒） 等,其中以含2、4个亚基占多数。奇数亚

基构成的蛋白质比较少，目前所知只有十

多种。亚基的种类一般是1—2种。 D2正四面体

第六节 蛋白质结构与功能的关系

一、 血红蛋白结构与功能的关系

血红蛋白和肌红蛋白是较早阐明空间结构的重要蛋白质分子。血红蛋白的结构比较复杂，它是由四个亚基聚合而成的四聚体，每项个亚基含有一个血红素作为辅基。正常人红细胞里存在着两种血红蛋白，HbA1占血红蛋白总量的96%，由2个α亚基和2个β亚基组合而成，即α2β2。 HbA2占血红蛋白总量的1.5%—4%，由2个α亚基和2个δ亚基组成，即α2δ2。胎儿的血红蛋白主要是HbF，即α2γ，出生后不久即消失，接着出现HbA1和HbA2。α亚基是由141个氨基酸残基组成2

的肽链，β、δ和γ亚基各含146个氨基酸残基。这几种亚基的三级结构都与抹香鲸肌红蛋白的结构极为相似，其中约有75%的主链形成8段右手α—螺旋，各命名为A、B、C、D···H，各段之间有长短不等的非螺旋部分连接，分别命名为NA、AB、BC、CD···HC，其中N与HC中的C是相应的末端。因此，各个残基都有两个编号，一个是从N端开始的顺序号，另一个是它在螺旋中的位置编号。如64位的组氨酸又可编为E7。血红蛋白是由四个亚基聚合成的四聚体，在四聚体中，四个亚基成D2正四面体分布，即四个亚基分布在正四面体的四个角上。

(一)、血红蛋白与氧的结合

血红蛋白与氧的可逆性结合可表示为： Hb + O2 HbO2， 其平衡常数为：K=[HbO2]/[Hb][O2]。与氧结合的血红蛋白称为氧合血红蛋白（HbO2），没有与氧结合的血红蛋白称为脱氧血红蛋白（Hb）。氧合血红蛋白与血红蛋白总量的百分比称为氧饱和度。即：氧饱和度（Y）= HbO2/（ HbO2+ Hb）×100% 。若以氧饱和度对氧分压作图，则得到一“S”型曲线，称为血红蛋白的氧合曲线。这与肌红蛋白的氧合曲线明显不同，肌红蛋白的氧合曲线为双曲线。

1.0 1.0 饱 0.8 肌红蛋白确良 饱 0.8

和 和

度 0.6 血红蛋白 度 0.6 Y=0.5

0.4 0.4

39

0.2 0.2 Po= 26(torr)

0 0 10 20 30 40 50 20 40 60 80 100 Po(torr) Po(torr)

活动肌肉时毛细血管中的Po 肺泡中的Po

从两者的氧合曲线图上我们可以看出，氧合肌红蛋白只有在氧分压极低的情况下才具有释放氧的能力，因此认为它有储备氧的功能。而氧合血红蛋白在氧分压为40（torr）时（静脉血的氧分压）已明显释放氧，而当氧分压到达20（torr）（肌肉运动时静脉血的氧分压）时血红蛋白只保留30%动脉血的氧含量。待氧分压到达4--5（torr）时，则供氧的任务已经由肌红蛋白所取代。

血红蛋白所表现出的特殊行为是它的四级结构以及由此而产生的变构效应所导致的。当一个α亚基与氧结合后，β亚基对氧的亲合力有所增加，而当一对αβ亚基与氧结合后，另一对αβ亚基对氧的亲合力增加。这一对亚基与氧反应的平衡常数可增加5倍。这种由一个亚基与氧结合时的构象改变而引起其余亚基构象和性能改变的作用叫做变构效应（别构效应）。许多蛋白质，尤其是酶都具有变构效应，变构效应是生物用以调节高分子功能（尤其是酶功能）极为普遍的方式。

(二)、氧合引起的血红蛋白构象变化

在脱氧血红蛋白中，四个亚基是通过如图所示的盐键相互联接起来的。

Asp His NH3+ COO- β2 94 146

Arg Asp Lys Val + COO- NH3 α1 141 126 40 1

Val Lys Asp Arg NH3+ COO- α2 1 40 126 141

His Asp COO- NH3+ β1 146 94

脱氧血红蛋白中不同亚基间的交联键（盐桥）

2

2

2

2

2

另外在两个β亚基之间还夹着一个2,3—二磷酸甘油酸（DPG），它带有高密度

+

的负电荷，其荷负电基团与每个β亚基的三个正电荷基团[1位上Val的 α—NH3，

+

82位上Lys（EF6）的ε—NH3和143位上His（H21）的咪唑基]相互吸引，共生成六个盐键。

由于上述这些盐键的作用，使脱氧血红蛋白的构象受到很大的束缚，致使它对氧的亲合力远比单独的α亚基、β亚基或肌红蛋白对氧的亲合力低。

血红蛋白与氧结合时，其分子构象要发生一系列的变化，主要的变化有以下几个方面：

40

①脱氧血红蛋白中Fe的配位数为5，其中4个来自卟啉环的N，另一个来自近侧组氨酸（F8）的第三位N。此时配位场较弱，Fe（Ⅱ）与卟啉环的四个N是通过电价配位键连接的，Fe（Ⅱ）采取高自旋结构，具有4个不成对电子，分布在4个轨道上，因此原子半径大，突出在卟啉环的中央空穴之外，与卟啉环平面保持0.06nm的距离。血红蛋白氧合后，Fe的配位数为6，O2是第六个配位体。分子氧使总配位场增强，此时，Fe（Ⅱ）是通过共价配位键与卟啉环的N结合的，Fe（Ⅱ）采取低自旋结构，4个不成对电子被挤到两个轨道内，原子半径比脱氧时缩小，于是能进入卟啉环平面的中央孔穴中，移动0.06nm的距离。这一移动通过与铁结合的组氨酸（F8）残基牵动残基所在的肽链。进而影响了亚基间的相互接触，以致整个分子的四级结构发生了变化。由于血红蛋白氧合时整个分子构象的变化都是由于Fe（Ⅱ）的位移牵引肽链所引起的，所以将血红素的铁看作是血红蛋白分子呼吸的“触发器”。

His（F8） C N HC CH O2 C N N HC CH Fe N 卟啉平面 Fe O O 氧合时铁原子进入血红素平面示意图

②F8组氨酸的位移引起亚基三级结构的微小变化，螺旋F向H移动，使二者之间的间隙缩小，将“袋穴”内的HC2Tyr排挤出去。HC2Tyr的移动，拉断了维系脱氧血红蛋白四级结构的某些盐键。

③两个β亚基间的空隙变小，挤出DPG分子，使DPG分子与两个β亚基间形成的盐键全部断裂。

④盐键的断裂，引起β亚基的构象变化，排出了β链67位（E11）Val的侧链对氧结合部位的空间障碍，使β亚基能够顺利的与氧结合。

⑤血红蛋白氧合时，其亚基间的相对位置发生相当剧烈地变化。血红蛋白可以看作是αβ二聚体的二聚体（即可以看作是α1β1和α2β2的聚合）。氧合时α1β1（或α2β2）接触区结构变化不大，但两个二聚体之间发生了相对位移，旋转了15°，使两个β亚基之间的距离彼此靠近。血红蛋白由T态（紧张态）变为R态（松弛态）。即血红蛋白由对氧的低亲合力型构象变成了对氧的高并合力型构象。

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氧合时血红蛋白中亚基构象变化的图解

血红蛋白四级结构的旋转变化 血红蛋白四级结构的滑动变化

氧合时一个二聚体相对于另一个二聚体旋 氧合时α1和β2链彼此滑动并更

转15°，C2对称轴自身倾斜7.5°。 换氢键的供给体

(三)、H、CO2、DPG对Hb与O2结合的影响

+

1． H对Hb与O2结合的影响—Bohr效应 +

H浓度或pH的变化可以影响血红蛋白对氧的亲合力。在肺组织中，CO2分压低、+

H浓度低、pH较高的情况下，血红蛋白与氧的亲合力增加，所以易与氧结合成氧

+

合血红蛋白。但在周围组织中，CO2分压高、H浓度高、pH较低的情况下，血红蛋白与氧的亲合力降低，所以氧合血红蛋白易释放出氧成为脱氧血红蛋白。这就是

+

Bohr效应，是由丹麦生理学家Bohr提出的。由此可见，H具有促进HbO2释放O2的作用。

++ 按照Bohr效应血红蛋白与氧结合的反应应写为：HHb + O2 HbO2 + H +

可见O2和H都能与血红蛋白结合，但是结合的方式相反。当氧浓度高时（肺

+ +

组织中），O2与血红蛋白结合，H被释放出来。当氧浓度低时（在周围组织中），H

+

与血红蛋白结合，而O2被释放出来。但O2和H不是与血红蛋白的同一部位结合，

42

+

O2结合在血红素的Fe原子上，而H则结合在血红蛋白β链146位组氨酸咪唑基以及α1链的缬氨酸的侧链上，使它们带上正电荷，并与其它荷负电的基团形成盐键。

2． CO2对Hb与O2结合的影响 CO2对Hb的影响有两个方面：一是与血红蛋白起作用，即与血红蛋白各肽链的N—末端NH2结合成氨甲酰血红蛋白。一般认为CO2与Hb的直接结合对CO2的运输起着一定的作用，但更重要的作用可能还是降低血红蛋白对O2 的亲合力，这一作用

-可初步解释为：带负电荷的氨甲酰基（Hb—NH—COO）与一个带正电荷的基团形成

+

盐键，起到降低氧亲合力的作用，有利于HbO2释放O2。二是间接地通过H参与Bohr效应。

3． DPG对Hb与O2结合的影响 DPG是血细胞中糖代谢的中间产物，它可以和脱氧血红蛋白以1:1的比例结合，使血红蛋白的构象发生变化，导致氧合能力下降。

Hb + DPG Hb—DPG

Hb—DPG + O2 HbO2 + DPG

目前认为，脱氧血红蛋白分子中，在两个β亚基间有一空隙恰好容纳一个DPG分子，一分子DPG能与两个β亚基空隙处的一系列正电荷形成盐键，使脱氧血红蛋白的构象更为稳定，所以能降低血红蛋白对氧的亲合力。氧合时两个β亚基相互靠近，空隙变小，DPG被排挤出去，氧亲合力也随之增加。

DPG降低血红蛋白对氧亲合力的作用有着重要的生理意义。当血液流经氧分压较低的组织时，红细胞中DPG的存在能明显增加氧合血红蛋白对氧的释放，以供给组织。DPG的浓度越大则氧的释放量越多。红细胞中DPG的浓度变化是调节血红蛋白对氧亲合力的重要因素。在空气稀薄的高山上生存的人们和患有呼吸困难性疾病的人们，红细胞中的DPG代偿性增加，使为数不多的氧合血红蛋白尽量释放氧，以满足组织的需要。有些鸟类的红细胞中不含DPG，但含有六磷酸肌醇等化合物，它在降低血红蛋白与氧的亲合力上作用比DPG更强。

+

综上所述，H、CO2、DPG均能使血红蛋白四聚体稳定于脱氧构象，造成血红蛋白分子对氧亲合力下降，从而有利于氧合血红蛋白在组织中释放氧。 二、 免疫球蛋白与防御作用

动物体对病原微生物的侵袭有防御作用。它们的防御方式有两种：①白血球向受侵部位的微生物方向运动，吞噬并破坏掉此外来侵袭物。②某些细胞（浆细胞）产生抗体，分泌到血液中，抗体与侵入的病原物质进行专一性结合而使之失去侵袭力。

凡能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。抗体是在抗原刺激下产生并能与抗原发生特异性反应的蛋白质，又称为免疫球蛋白。抗体是具有高度专一性的蛋白质，主要存在于血清中。正常血清中含有大量的蛋白质，在电泳时按照迁移率大小可分为白蛋白、α—球蛋白、β—球蛋白和γ—球蛋白。动物经注射抗原后产生的含有一定数量抗体的血清称

+

43

为抗血清或免疫血清。抗血清和正常血清比较，其电泳图谱有明显的变化，血清中的γ—球蛋白显著增加。所增加的球蛋白就是抗体，目前国际上统一命名为免疫球蛋白。简称Ig。

A A γ 蛋 蛋 白 白 质 质 浓 γ 浓 β 度 α β 度 α

迁移距离 迁移距离

正常血清电泳扫描曲线 抗血清电泳扫描曲线

抗原起作用的通常是蛋白质或多糖分子表面的某些部分，可以与微生物的表层结构结合在一起，所以细菌、病毒及细菌毒素的表面都有不及一个抗原部位，因而可以诱导出多种不同专一性的抗体分子。在血液中抗体与相应抗原结合就修改了微生物的表面结构，不但使白细胞容易吞噬微生物并将它们消化掉，而且多数抗原与抗体相连接成为沉淀而失去活力的复合物，使之失去侵袭力及毒力。抗原主要来自异种生物或同种生物的异体。抗体有识别“自己”与“非己”的能力。近年来由于分子生物学的进展，使我们对免疫球蛋白的三维结构及其与抗原的结合部位有了深入的了解，从而对免疫球蛋白识别“自己”与“非己”的本领有了一定的认识。下面我们简要介绍这方面的有关问题。

(一)、抗原

抗原一词最早的概念是指一种能在脊椎动物体内引起抗体产生并与相应抗体起反应的物质。但抗原诱发的动物反应是复杂的，不同抗原或同一抗原对不同种类或个体可能引起不同的反应，可以产生抗体，即体液免疫，也可以致敏免疫细胞，即细胞免疫。但无论如何，抗原能和抗体或致敏啉巴细胞在体内或体外发生特异性的结合。所以抗原的概念有两个重要的方面，即免疫原性和抗原专一性。免疫原性是指引起免疫反应的能力，而抗原专一性是指与抗体的反应特性，这种专一性是由抗原的化学结构即整个分子的空间构象以及局部基团决定的。

1. 抗原专一性的分子基础

抗原分子中起主要作用的是分子表面化学基团的立体构型及其空间排列图式，这些化学基团称为抗原决定簇。天然抗原大多数是蛋白质，其结构复杂，且专一性的分子基础不易分析。所以可采用人工抗原来进行抗原专一性的研究。人工抗原是将已知结构的简单分子连接在蛋白质分子上，例如将苯胺的衍生物（如对氨基苯磺酸或对氨基苯甲酸等）先重氮化，再通过酪氨酸残基与蛋白质相联，形成的偶氮蛋白质就是人工抗原。

COOH COOH COOH

44

NaNO+ HCl 蛋白质 （重氮化） （偶联） 2

OH + NH2 N N N N

CH2

（蛋白质）

对氨基苯甲酸与蛋白质偶联形成的人工抗原

这些简单分子称为半抗原，而与之结合的蛋白质称为载体。在人工抗原中，半抗原是抗原决定基，具有高度的免疫学专一性，即由这些简单的化学基团决定了抗原专一性。所以。可以利用半抗原分子结构上的变化来研究抗原与抗体反应的专一性。例如，可以将对氨基苯甲酸换成邻位氨基苯甲酸、间位氨基苯甲酸，也可以将对氨基苯甲酸换成对氨基苯磺酸、对氨基苯砷酸等等，再分别免疫动物，通过抗原抗体的反应来研究抗原的专一性。经研究发现，抗原与抗体的反应决定于抗原决定簇的空间构象与抗体空间构象之间互补的密合程度。可见抗原的专一性主要依赖于表面决定簇的形状和稳定性。这就证明抗体只和抗原分子表面的一定化学基团起反应，而不是和整个大分子起反应。这些化学基团就是抗原决定簇。

2． 抗原免疫原性的分子基础

对于作为抗原的蛋白质大分子来说，它们的免疫原性和抗原专一性决定于暴露在大分子表面的各种决定基的空间排列图式。抗原专一性决定于分子的各级结构。但免疫原性除决定于分子构象之外，更重要的是决定于以下几个因素：①外源性。抗原分子表面应具有免疫活性细胞从来没有接触过的决定簇。②分子的大小。一般情况下，分子量应大于10000。例如，卵清蛋白的分子量是40000，是一个很好的免疫原。低分子多肽或蛋白质片段也能引起免疫反应，但应的一定的条件，例如，加佐剂才能成为很好的免疫原。③分子结构和立体构象的复杂性。分子结构和立体构象复杂者，抗原性强。例如，含芳香族氨基酸的蛋白质比不含芳香族氨基酸的蛋白质抗原性强。所以，抗原分子的大小、形状只有在反映出其分子结构的复杂性和有效决定簇的数目及其复杂的排列图式时才会具有免疫原性，才是良好的免疫原。

(二)、抗体

抗体是能与抗原专一结合并引起沉淀的蛋白质分子。抗体和其他蛋白质分子一样是细胞的产物，存在于体液中或表现在细胞的表面上。通常称其为免疫球蛋白，简称Ig。

1． 免疫球蛋白的结构

45

正常动物血清中含有多种免疫球蛋白，其基本结构和化学性质都是相似的。含量最丰富的是IgG（丙种球蛋白）。化学研究表明，IgG分子是由两个相同的“重链”和两个相同的“轻链”组成，各链之间有二硫键相连。

Porter在1957年用木瓜蛋白酶处理IgG，将其断裂成三个片段，其中两个是相同的，各有一个抗原结合部位，命名为Fab片段（抗原结合片段），另一个片段在抗原结合时不起作用，易结晶，命名为Fc片段（可结晶片段）。但Fab片段与抗原结合后并不沉淀，因为它们是单价的，不能产生交联晶格。

Porter进一步用胃蛋白酶处理IgG，，将其断裂成一个Fc片段和一个二价抗原结合片段，命名为（Fab′）即由二硫键连接起来的两个Fab片段。（Fab′）2，2片段与抗原结合后能够沉淀，因为（Fab′）2片段是二价的，与抗原能形成交联晶格。

Fc Fc

s s s s s s 木瓜蛋白酶 s s 胃蛋白酶 s s s s s s s s s s s s s s s s

Fab Fab （Fab′）2

免疫球蛋白分子中只有很少的肽键对水解酶敏感，用酶处理时断裂的部分只限于暴露的肽链柔韧区（即绞链区），而肽链的其它部分均紧密盘绕，酶不易接近。

使用抗体抗原复合物为材料，可在电镜下观察到抗体分子的实际形状。格林（M.Green）和瓦伦丁（Valentine）曾在一个八碳链的两端各连接一个二硝基苯基，制成了二价半抗原，如图所示：

O2N N N NO2

NO2 O2N 0.25nm

可表示为：

此二价半抗原可以和抗体结合。在电镜下观察游离抗体时，看不见确切的东西，但此二价半抗原和抗体结合成复合物时，在电镜下可见它们呈三角形或多角形结构，并在拐角处有突起。这说明半抗原分子与三个或更多的抗体分子交联。至于半抗原分子，由于太小，因而电镜下不易看到。

二价半抗原与抗体分子交联 二价半抗原与（Fab′）2交联

46

经胃蛋白酶处理IgG得到的（Fab′）在电镜下2片段与二价半抗原分子反应时，

仍能看到类似的几何结构，但拐角处没有突起。因此，拐角处的突起可以断定是抗体分子的Fc片段。这就充分说明IgG有两个与抗原专一性结合的位点，分别在两个Fab 上 。

2. 抗体分子的一级结构

抗体分子的氨基酸顺序是相当有趣的，因为这些顺序的稳定性和多样性是显示抗体稳定性和特异性、多样性的分子基础。蛋白质一级结构的确定必须使用纯净的蛋白质，即不得有任何其他蛋白质的污染。确定抗体分子的一级结构是十分复杂的过程，这是由于免疫球蛋白本身就是由很多不同类型的抗体分子组成的。一个免疫纯的抗体样品中所有抗体分子都有完全相同的抗原结合特异性，但它们在化学组成和结构上并不完全相同。换句话说，抗体分子的组成是十分不均一的。所以，具有相同抗原结合特异性的抗体分子，在它们的氨基酸组成上仍有微小的差异，目前的方法还不可能将它们区别开来。但幸运的是，有一种恶性疾病叫做多发性骨髓瘤，它实际上是一种合成免疫球蛋白的细胞（浆细胞）的肿瘤。这些肿瘤细胞能产生单一类型、化学结构相同的免疫球蛋白G。实际上这并不是一种真正的抗体，但它们与正常的免疫球蛋白G的结构相同，这就为其一级结构的研究提供了极大的方便。

免疫球蛋白G由四条肽链组成，其中两条的分子量为53000，称为重链（H），另两条的分子量为22000，称为轻链（L）。轻链由214个氨基酸残基组成，从C端开始到第107个残基的顺序在不同抗体间是完全相同的，但从N端开始到第107的氨基酸残基的顺序则随抗体的不同而异。因此轻链可分为两部分，即可变区（VL）和恒定区（CL）。重链也是这样，重链由446个氨基酸组成，从N端开始到第116个残基为可变区（VH），从C端开始到第330个氨基酸残基为恒定区（CH），其长度约为可变区的3倍，分别为CH1、CH2、CH3。IgG分子中共有16个二硫键，其中12个链内二硫键，4个链间二硫键（如图所示）。在可变区内有所谓的高变区，几乎所有的氨基酸顺序变化都发生在此区域内。可变区内其余的顺序比较恒定，这可能是形成免疫球蛋白的基本结构单位所要求的。VH的高变区和VL的高变区一起组成抗原结合部位，每种抗体的特异性决定于轻链和重链高变区的氨基酸顺序。恒定区与抗体的特异性无关，主要决定着抗体结构的稳定性。重链的CH1和CH2区通过一个“绞链区”（长约30个氨基酸残基）相连，绞链区有胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用位点。在CH2区还有补体结合位点，具有结合补体的能力。

47

免疫球蛋白IgG分子结构示意图

3． 抗体分子的特异性和多样性的分子基础

IgG分子可为成12个结构域。每条轻链有2个结构域，一个在VL区，一个在CL区；每条重链可分成4个结构域 ，一个在在VH区，三个在CH区，CH1、CH2、CH3各一个。每个结构域由两层反平行β—折叠片组成，两层β—折叠片之间有二硫键相连。可变区中由3个高变圈排列成高变区，高变圈是β—折叠片之间的回折连接片段，重链和轻链的高变圈集合在一起形成抗原结合部位，此结构部位从分子的立体结构上看，是由重链和轻链可变区折叠盘曲成的开口向着N端的空穴，那些高变区的氨基酸就分布在空穴的表面。既然高变区的氨基酸是多变，因此，此空穴的形状也必然是多变的，将随抗体的不同而不同，从而有可能和成千上万的抗原进行特异性的结合。

柔韧的绞链区能使Fc和Fab之间相对移动。抗体分子在没有结合抗原时，分子形状呈T—形；但当Fab与抗原结合后，通过绞链区弯曲变形呈Y—形。抗体分子从T—形变成Y—形，使隐蔽的补体结合部位暴露出来，启动了一系列与补体有关的反应。

4． 免疫球蛋白的种类

免疫球蛋白有五种，即IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。这五类免疫球蛋白在重链的恒定区有结构上的差异。比较CH区的氨基酸顺序，结果表明存在五类重链，即α、γ、δ、ε和μ，α和γ中分别含有α1、α2和γ1、γ2、γ3、γ4亚类。各类免疫球蛋白的组成如下：

各类免疫球蛋白和组成

类别 重链 IgG γ IgA α IgM μ IgD δ IgE ε 亚类 γ1、γ2、γ3、γ4 α1、α2 / / / 轻链 κ或λ κ或λ κ或λ κ或λ κ或λ 分子式 γ2κ2或γ2λ2 (α2κ2)2或(α2λ2)2 (μ2κ2)5或(μ2λ2)5 δ2κ2或δ2λ2 ε2κ2或ε2λ2 含量 80—85% 10% 5—10% 1% 0.01%

各类球蛋白中含有数量不同碳水化合物：IgG含2.9%, IgA含7.5%, IgM含11.8%, IgE含10.7%。五类免疫球蛋白在功能上也有所差异，IgG是机体的主要免疫能力；IgA不能被消化道所消化，子代可从母乳中直接摄入体内，所以在获得性

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免疫中具有生要意义；IgM是动物免疫后最早出现的抗体；IgE与某些过敏反应有尽有关；IgD的功能目前还不清楚。

第七节 蛋白质的分离、纯化与鉴定

蛋白质（酶）的制备是一件十分细致的工作，有时制备一个较高纯度的蛋白质（酶），需要付出很艰巨和长时间的努力。制备工作涉及到的物理学、化学和生物学的知识面很广。根据物理或化学的某一原理建立起来的各种分离、纯化方法虽然在不断改进，但其主要原理不外乎两个方面。一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。由于蛋白质（酶）不能熔化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，可以在这两相之间互相交替进行分离纯化。

按照蛋白质（酶）的分子量大小、形状、带电性质及溶解度等主要理化性质建立起来的分离纯化方法如下： 性 质 分子大小和形态 溶解度 电荷差异 生物功能专一性 具 体 方 法 超速离心、超滤、分子筛（凝胶过滤）、透析。 盐析、有机溶剂抽提、分配层析、逆流层析、结晶 电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析、吸附层析 亲合层析 由于不同的生物大分子结构和理化性质不同，分离方法也不一样，就是同一种生物大分子，选用了不同的材料，使用的方法也差别也很大。因此很难有一个统一标准的方法对任何生物大分子都可以循用。所以在实验前要进行充分调查研究，查阅有关的文献资料，对自己所欲提纯物质的理化及生物学性质要先有一定的了解，然后才能着手进行实验工作。对一个未知结构和性质的试样进行创造性提纯时，更需要进行各种方法的比较和摸索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。其次，在进行分离纯化工作之前，常常需要建立相应的分析鉴定方法，以便正确指导整个分离纯化工作的顺利进行。高度提纯某一生物大分子，一般要经过多种方法、步骤和不断变换各种外界条件才能达到目的。因此，整个实验过程中各种方法的优劣、所选条件的分离效果好坏，均需通过分析鉴定来判别。例如，分离纯化酶时，常需测定酶的比活力及溶液中蛋白质的浓度指标。

蛋白质（酶）的分离纯化过程一般可分为以下几个阶段： 一、 材料的选择与处理

动物、植物及微生物都是制备蛋白质（酶）的材料，选什么材料主要依靠实验的目的而定，一般应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原材料。如果是为了科学研究，则不必全面考虑上述问题，取材只需符合实验预定的目标

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