ErbB2通过FAK—Src—MAPK信号通路诱导细胞转化和移动侵袭

中国病理生理杂志

C ieeJu a o a ohs lg 20,4 1 ) 26 2 6 hn s r l f t pyioy 0 8 2 ( 2:3 3— 35 on Ph o

26 33

[文章编号] 10 4 1 ( 0 8 1 2 6 0 0 0— 7 8 2 0 )2— 33— 3

E b 2通过 F rB AK—S c—MA K信号通路 r P

诱导细胞转化和移动侵袭.

何强，梁力建，彭宝岗，李绍强，汤地，阿力亚 (中山大学附属第一医院肝胆外科，广东广州 5 0 8 ) 10 0

[摘

要]目的： 探讨表皮生长因子受体 2 Eb2诱导肿瘤转化和侵袭的分子机制。方法： (r ) B用表达 Eb 2 rB

逆病毒颗粒感染 F K细胞， s r印迹检测 E b 2在 F K“ A Wet e n rB A细胞中的表达，免疫沉淀检测 Eb 2的功能。用 rB Sc r阻断剂一P 2阻断 Sc用 MA K阻断剂一U 16阻断 MA K, P r, P O2 P观察 Sc M P r或 A K被阻断后对 Eb 2诱导的细胞 rB移动和细胞转化的影响。结果：感染后 Eb 2在 F K细胞中稳定表达和激活。P 2抑制 E b 2诱导的 F K磷 rB A P rB A酸化以及 Eb 2诱导的细胞移动。U 16阻断 Eb 2诱导的 MA K磷酸化以及 Eb 2诱导的细胞锚定依赖性生 rB O2 rB P rB存一细胞转化。结论： rB Eb 2通过 F K—Sc—M P A r A K信号转导通路诱导 F K细胞转化和移动。 A

【关键词]受体，表皮生长因子； A Sc M P F K— r— A K通路；瘤侵润肿[中图分类号] R 6 33[文献标识码] A

On o e i r n f r a i n,mi r t n a d i v sv n s fc l d c d b c g n c t a so m to g a i n n a i e e so el i u e y o snEr B2 a e m e i t d v a FAK—Sr b r da e i c— M APK inai t sg lng pa hwa y

H i g LA G L— in P N a E Qa, I N i j, E G B o—gn, I ho in, A G D, i a n a a g L a—qag T N i A L—y S( eatetfHp t iayS re,TeFr f it o i l S nY t snU i￣t, unzo 10 0 hn

. Dp r n ea bl r u r h itf l e H s t, u a— e nv i G a ghu5 0 8,C ia m o o i gy sA a d p a i e yE— al l qag ht alcn) m i h in@ om i o :e .

[ B T A A M:T x l etep si lyta Eb 2一idcdo cgnct nf m t nad i ai . A S R CTl I oepo os it h t rB r h bi n ue noe i r s r ai n n s ni a o o v o nv le F o v AK—S c—MAP sg a ig p t w y M ETHODS:P r n a AK r K in l ah a . n ae t F l c l r n e td b e r el we e if ce y r t s o—v co at l s e trp r c e i

e p e sn r B x r s i g E b 2.E p s in o r B n t n t n w r s a e y W e tr lt n n mmu o r cp ai n e p c x r so fE b 2 a d i f ci e e a s y d b s n bo t g a d i e su o e i n p e i tt,r s e - o t ey S n i i r P rMAP h bt rU 2 su e od tc r rMAP f n t n o b 2一i d c d c l o c— i l. r i h bt 2 o v e oP K i i i O1 6 wa s d t ee t c o n o S K ci n Er B u o n u e el n o g nc t n f r t n a d mir t n RES e i r so ma i g ai . a o n o ULTS:Er B so e e p e s d a d f n t n l c iae n F b 2 wa v r x r s e n u ci a y a t td i AK c l .Th ol v“ el s ep o p oy ain o A i d c d b r B a n ii d b P h s h rl t fF K u e y E b 2 w si h b t y P 2,a d t e i h bt n o AK y P 2 w sa s cae i o n e n h i i o fF n i b P a o itd w t i s h m—

p i d c l mi a in a d i v so . U 2 l c e h s h r lt n o ar el g t

n n a in e r o O1 6 b o k d p o p o ya i fMAP n u e y E b 2,a d W e p n il o o K id cd b r B n a r s o sb e t s i ar d a c o a e—d p n e tc l s r ia n s f a a . mp i n h r g e e e d n el u vv i ot g r CONCLUS ON:C l o c g nc t n f r ai n l I el n o e i r so a m t,mir t n n o g ai,a d oi v so n u e y E b 2 ae me it d v a F n a in id c d b r B r d ae i AK—S c—MAP i ai g p t w y r K sg l n ah a . n

[ Y WOR S R cpo, pdr a go t co; A KE D] eet eie l rwhf t F K—Sc—M P ah a; epam ivs e es r m a r r A K ptw y N ol ai ns s n v

表皮生长因子受体 2 Eb 2属于酪氨酸激酶袭是否通过 F K— r— A K信号通路。 ( rB ) A S MP c 受体。过量表达 Eb 2 rB与人体肿瘤的高侵袭性和预材料和方法后不良有密切关系¨。焦点黏链激酶 (oa d ein fcl hs a o kns, A是一个主要的焦点黏连蛋白，细胞生 1细胞株和细胞培养 iae F K)在存和迁徙过程中起重要的作用’。我们以前的研 小鼠胚胎纤维原细胞 F K A 细胞培养于究表明，A F K在调节 Eb 2诱导的细胞生存、瘤形 D M, rB肿 ME该介质含有 1%胎牛血清 ( B ) 1m o/ 0 F S、 m lL 1链霉素。 成和侵袭等方面起着重要的作用，机制可能涉及丙酮酸、%非必需氨基酸以及青/其到 F K—Sc A r—MA K转导途径。本实验使用 Sc 2抗体和试剂 P r、 M P A K阻断剂分别阻断 F K蛋白作用分子 S A r c和 A t— rB一 ( b一3 coe3 5购自 O c— ni Eb 2 A, l B ) n no M P通过观察 S A K, r MP c和 A K信号对于细胞转化和 gn;ni A ( e e at—F K A一1 7,C一2 )自 S n rz 0购 a t Cu; a移动的影响而阐明 Eb 2诱导的细胞转化和移动侵 a t— h sh t

oiea t o y( G1 ) at h sh rB ni p op o rs ni d 4 0和 ni op o y n b p[收稿日期] 07 1— 4 20— 1 1E—ma l h q a g h t i c m i:l e in@ o mal o .

[回日期] 08 0— 9修 20— 2 2

[基金项目]广东省自然科学基金资助项目( o7068 N .0 13 )

一

MA K( 2 4 )及 MA K( 2 4购自 U s t; P 4/4以 P 4/ 4) pt e a

C TL b Er B2 Er B2- b -￣

CT 0 i O n HRG L 1 m n 3 mi

H rg l ( R购自 N o ak ro eeui H G) n em res 3细胞转染

F- A￣ K圃G APD H -￣ - IA

pr2圈圈 —b - EB*" EB- r2豳豳圈 b-￣B

应用表达 Eb 2受体并带有强化绿荧光蛋白 rB(n a cdgenf oecn rt n E F ) eh n e re urset oe, G P的双顺反 l p i

子逆载体方法稳定转染 23包装细胞， 9产生重组逆病毒颗粒。用 A 2一 rB P Eb 2逆病毒颗粒重组体转导细胞。于 2 4孔培养板中每孔植入 2 1× 0细胞，加入浓缩 10倍的逆病毒， 0连续感染 3d 。稳定转导细胞的进行扩增。4 We en印迹和免疫沉淀( i m o rc i f n 1 ) sr t hl n pei ti,1 t pa o '

F g 1 Er B so e e p e s d a d a t ae n F i b 2 wa v r x r s e n c i td i AK v“ cl . el s A:F AK c l e e i fce y r t v eo s p r ce el w r ne td b er e tr at l s s o i

e p e s g E b 2.Cel t a tb ye p e s d E b 2 w r x rsi r B n l h t a l x r s e r B e e s s c o e a d x a d d We tr b ot g h w d h t l n d n e p n e . se n l t n s o e t a i

E b 2 wa o e e p e s d B: E b 2 wa a t ae n r B s v r x r se . r B s ci td i vF AK c l . e1 a 0 el C 1 t% o 0 f e c r tr e s s 7 fc n u n e w

el sa v d l e

i e l— fe d a f r 1 n snm r e me i o 6 h, a d t e r ae i n h n te t d w t h

细胞长至 7%汇合度，良 RP 0改 I A液裂解细胞， 提取蛋白和测定蛋白浓度。取等量蛋白，特异性 加抗体，下孵育 9 i,蛋白一A或蛋白一G琼 4℃ 0mn加

H G(0 R 2 L o 1 i,3 i,rset e,o )fr 0 m n 0 m n epci l r vy kp ut a d(o t l C L .I m npeiit nad et nr t cnr, T ) m u orc t i ee o p ao nWe tr lt n h we b 2 wa ci ae n t e p e - se n b o t g s o d Er B sa t td i r s i v h e c ra sn eo n eo b e c fHRG.

E b 2在 F 细胞中过量表达和激活 AK脂珠 4o下孵育 6 n【= 0mi。免疫复合物进行聚丙烯酰图 1 r B r、 AK磷酸化。而阻断进氨胶电泳 ( D S S—P G分析，转至硝酸纤维膜。 2 P 2阻断 S c抑制 F A E)并 P rB 5%脱脂牛奶室温下封闭 1h加 I抗 4 q孵育 E b 2诱导的细胞移动和侵袭 , C下免疫沉淀以及 Wet n印迹分析显示， R sr e H G刺 4h加Ⅱ抗室温下孵育 4 i。使用 E L显影系统 , 0mn C激 1 i,A 0 mn F K呈现磷酸化改变， Eb 2诱导的而 rB 进行荧光显影，胶片曝光、冲洗。膜用 S i B f r tp u e于 r F K磷酸化可以被 Sc A r阻断剂 P 2所抑制， P见图2。 A 5 0℃下作用 3 i,闭后再分别加入 I、 0mn封抗Ⅱ抗孵细胞移动侵袭实验显示， R H G促进细胞的移动育，C E L显影、片曝光。胶 和侵袭(4 33± 38 8 2.6 7 77 7, 5 .33 1.64 16 6± .65 P< 5锚定依赖性细胞生存 0 0 )而这一作用可以被 Sc阻断剂 P 2所抑制 .5, r P细胞生长至 7%汇合度，ys 0 tpi r n消化，用全细胞 ( . 3 3- . 1 9 5 . 3 3±1 .6 4 P<0 0 ) 8 3 3 4 5 1 4 3 3 - 3 3 88, .1,

培养液悬浮。将 500个细胞重新悬浮于 0 3 见

图 2。 0 .% B Salqe脂糖中 (全细胞培养液稀释 )并倒在 3 U 2制 MAP磷酸化、 ePau琼用， o16抑 K阻断 ErB b 2诱导的 07 Sal u脂糖层。细胞置于 3℃培养箱细胞生存 .% ePa e琼 q 7免疫沉淀以及 Wet印迹分析显示， R sr e n H G刺中， 3d换含有或不含有 U 16的全细胞培养液每 O2 0rn MA K呈现磷酸化改变， M P a而 A K这一磷 (含有或不含有 H G, gL。4周后计算细胞克激 1 i, P R 2/) 0酸化可以被 U 2抑制，图 3。 O16所见 A隆数，克隆直径大于 2 x 0/ m者为阳性。 软琼脂细胞锚定依赖性生存实验显示， R H G促 6体外细胞侵袭实验进细胞锚定依赖性生存 ( 3 16± 1.16 7.6 7 634使用 8 m裹有 m t e的多孔单元进行细胞移 ai l r g 3.3 3±1.6 6 P<0O )而这一作用可以被 233 396, .1,动和侵袭实验。在单元的上部加入或不加入 P 2下 P, U 16所抑制 ( .00± 2 64 7.67± O2 650 .66 3 16 部加入 2 gLH G作为趋化物， 0/ R连续培养以让细 1. 16, 0 0 )见图 3 6 3 4 P< . 5, B。胞通过 maie, 4 tgl至 8h时对 m tgl层的侵袭细 r ai下 re讨论胞进行固定、色和计数。染 Eb r B受体促进肿瘤生长和侵袭，其机制与细胞 7统计学处理分子信号转导放大有关。体外实验显示， F K富在 A实验重复 3, 3次的平均值，次取数据用均数± 含细胞中过量表达 Eb 2促进细胞的移动和侵袭。 rB 标准差 ( s表示。两组间比较用 t± )检验。 相反， F K细胞中过量表达 Eb 2细胞不能在 A一 r, B结果在软琼脂中生存，在小鼠体内也不能成活并形成实体瘤，细胞也缺乏移动和侵袭功能。这些结果提示 1 E b 2受体在 F 细胞中稳定表达和激活 rB AK Eb 2诱导的细胞转化和侵袭依赖于 F K功能； rB A Wet nbot g显示，生型 ( i s r l i e tn野 wl y e WT) d—t, p F K在调节 Eb 2诱导的细胞生存、 A r B肿瘤形成和侵 F K细胞中 Eb 2表达水平低。感染

Eb 2逆袭等方面起着重要的作用 J A rB rB。 病毒颗粒后，rB呈现过量表达，图 1。 Eb 2见 A Eb 2可以与多种信号分子发生作用， rB也可以被免疫沉淀以及 Wetr s n印迹分析显示， e无论有无 F K所召集。F K的激活可以引发多种信号分子的 A A H G的刺激，rB都表现为激活状态， R Eb 2见图 1。 B激活，中包括 Sc酶和 Ga 2激活的 Eb 2其 r激 rb。 rB和

23 5 6

P 2可以抑制 F K的磷酸化，且抑制 Eb 2诱 P, A并 rB导的细胞移动和侵袭，提示 Eb 2一 A Sc r B F K— r信号通路与细胞移动和侵袭功能有关。这一结果与文献 C n o o f lHR G HRG+ P P 2报道相似。Shape等和 Weto等研究提 clefr s f h p- FAK—示 v—Sc诱导的肿瘤形成可能通过 F K—Sc— r A r MA K信号通道而实现。 Oai e等¨ P|y y o研究显示， F AK+ q ,一u 0 b s u g一 0 F K是 MA K的激活过程中一个重要的中间体。我 A P Co to HRG HR+ P nr l G P2们实验显示，用 M P阻断剂 U 16可以阻断使 AK 02 A B P进 rB F g 2 P 2 b o k d p o p o ya in o A a d c l mir t n i P l c e h s h r lt f F K n el ga i MA K的磷酸化，而阻断了 Eb 2诱导的细胞转 o o化，提示 M P A K可能是 Eb 2 F K下游信号分子， r/A B a d i v so n u e y Er B .A:c l t 0 n n a in id c d b b 2 el a% o o— s 7 fc n l n e wee s v d i e u f e c r tr e n s r m—f e me i o 6 h,a d u a r d a f r1 e n 可以被 F K所召集， A并转导信号。因此，rB诱导 Eb 2 te r—t ae i rwtot P ( 0n lL o的细胞转化可能涉及到 Eb 2一F K—MA K信号 h npe r t wt o i u P 2 5 mo )f e d h h / r rB A P 3 i, oo e yt ete t i G( 0 g L转导通路。 0 mn f l d

b et a n wt HR 2/ ) lw h r m h一

fr 1 n C l r y e i d f d RI A a d 0 0 mi . e l wee ls d w t mo i e P n s h i

sbet oi m npeii t na d Wet n bo i . ujc d t m u o r p a o n s r ltn e c ti e tgT e f u e s o e h s h r lt n o AK n u e b h g r h w d p o p o y ai f F i o id c d y E b 2 w s ih b td b P . B:c l mi a in a d i v - r B a n i i y P 2 e el g t n a r o n s n a s y s o e inf a t e r a e n a ie c l i s a h w d sg i c n l d c e s d i v sv el o i y s s e n P 2 go p c mp r d wi e n i P r u o ae t HRG o p f . 3 3± h r g u 8 3 3

[参

考

文

献]

[] Sa nD,CakG 1 l J l M,WogS mo r n G,e a.H ma rat t 1 u n be sc n e:c rea in o ea s n u vv l t mpi c— a c r o r lt fr lp e a d s r ia h a l a o wi i f

tno eHE i fh R一2 nuo cgn J .Si c,18 o t/ e n oe e[] ce e 97, n

2 5 4 8 ) 17—12 3 (7 5:7 8. 3 5 1 5 . 33±1. 64, . 19 433 3 8 8 n=3,P< . 1,sg 0 0 ) u-『] IcD, u t Y, aaa aS e a eue e ti 2 l Fr a i u K nzw , t .R dcdclmol 1 l i.g si g el e t c l n mi ain n iv so w r i h b td y r o g t a d n a in e e n ii b eP 2 P . t n n a c d f a a h so o t c o ai n i el y a d e h n e o l d e in c na tf r t n c l c m o s

f m F K— df i tmi l . N tr, 19,37 r A o ec n i e c 1 a e 9 5 7 e J u

图 2 P 2阻断 F P AKK的磷酸化。进而阻断

E b 2介导的细 rB ( 59:3 5 4 6 4 )5 9— 4 .胞移动和侵袭[] See P R a D, a i R e a.Eeae x rs 3 igl M, ynE C r f D, t 1 l t epe- d v dso fa tv td fr so u r B—2 a d E b—3 a e in o cia e m fNe/eb— r B— r o n i v le n t e i d c in o mma y t mo si r n g n c n ov d i h u t f n o ma r u r n t s e i a

m c:ipi t nf u a rat a cr[] M OJ ie m lai r m nbescne J .E B, c o oh Co t l nr o HRG HRG+ O U

1 9, 8 8: 1 9— 1 4 9 9 1 ( )2 4 2 6 .

p M A K - P42 4/ 4

Ml P A K42 44/

[]何强， 4黄美近，彭宝岗，等.Eb 2诱导的肿瘤形成和 rB侵袭有赖于 F K功能[]中国病理生理杂志， A J.20 2 (2 0 7. 3 1 ):2 6 3 9—2 7 . 3 3A B

[] Sh l D, lern D, hno W,e a.A t 5 ca e M Hi badJ S annJ l r d t 1 uo—p o p o y ain o h o a d e in k n s,p 1 5 AK, h s h r lt ft e fc la h so i a e p 2 F o

Fg 3 i

UO lc e h s h rl t n o b o k d p o p o yai f MAP a d o c g n c o K n n o e i t n fr t n o el n u e y Er B . A:c l t r s ma i f c l id c d b b 2 a o o s el a s 7% o o f e c r e m—sa v d fr 1 0 fc n u n e we e s r l u tr e 6 h,a d o n

d et S 2一 dpn etbn i fp 6 Sc[] o i cs H r e dn idn o p0 r J .M l e g

C lBo, 94, 4 3:60—18 . e i 19 1 ( ) 18 l l 68 t np—ra dwt o i ot o(0p o/ ) fl h r t t i r t u e e ee h w h u i m LL, -[] Ha a ei L o 6 m g h M, t ysi O n

si e .pO u Ma uoh Y, h i t s h B, a 6 v— 1 S c c u e y o i e p o p oy ai n a d i a t ai n o e r a s s tr sn h s h r lt n c i t ft o n v o h l e ytet a e twt HR (0 g L f 0 o db h r t n i G 2 / ) o 1 w em h r mn e sw r sdad sbet s r l t g i.C l eel e n ujce Wet n boi . l y d e tn N—cd ei a n el dei yt[] M O a hr n—ct i cl ahs nss m J .E B en o eT e f r h w d h t h s h rl t n o h g e s o e ta p o p oy ai f MA K i- i u o P n

J 9 3 1 ( ) 3 7— l .,19。2 1: 0 3 4

d c d b r B s n i i d b u e y E b 2 wa i hb t y UO.B: h u e f e t e n mb roc l co e a in f a t e r a e O r u O e l l n sw ssg i c nl d c e s d i U g o p C B— i y n p e i r a d w t HRG r u ss o y t e a s y o n h r h g o p a h wn b h a fa c o s

[] I yR Ma C p o, t .A t a n R ua 7 r B, oD, o pl J e a c vt gS Cm t b a 1 i i‘ t ni u sto da cd h m ncl a cr J _ i nasbe f vne u a o n cnes l o a o JN t￣e, 99, 1 2:8 a G n t 19 2 ( ) l7—10 9.

a e d p n e ts r ia f c l n s f a a ( . 0 0± g e e d n u v lo el i o g v s t r 6 50

[] Shape D Jn s C H ne T ut l G b 8 clef D, o e, u tr .M lpe r2一m - r K i ed ae n e rn si ltd s ai g p t w y K2 mi itd i tg i t mua e i ln ah a st ER/ n g o tg n— a t ae r ti ia e u oe ci td p oe n k n s:s

mma in o o h c— v t fb t o

2 64 7 .6 7±1. 16 n=,P<0 0 ) sg .66 3 16 6 34, 6 .5, u-g sig c l o c g n c ta so ai n i d c d b r B e t e l n o e i r n f r t n u e y E b 2 n m o wa n i i d b s i h bt y UO. e

S c— n o a d e in k n s— nt td t rsn h s r—a d f c la h so i a e— i i ae yo ie p o - i

图3 U 2( 016 UO)阻断 E b 2诱导的 MA K磷酸化以及 rB P细胞转化

p oy t neet J .M lC l Bo,19,1 ( ) hr a o vns[] o el i li l 98 8 5:2 71—2 8 . 5 5 5

F K均可以与 Sc产生作用。c—Sc通过 F K的 A r r A td p o p o yai n o c d e in k n s o pe ci e h s h rl t ff a a h so i a e c u ls a t o o l n Tr 9 y一37与其发生作用 L。 H G可以上调 c—Sc s R J r n d ei y a i sv v gl n J .M l e a dah s nd nm c t ri l i aig[] o C l o so u a s n l位于 25区域的酪氨酸磷酸化， 1增强 Sc酶的活 r激 Bo, 04, 4 1 )8 1 il 2 0 2 ( 8:13—83 . 13 性， Sc性增加与细胞之问黏附的减少有关 J[ 0 Oai eM而 r活， 1] l o A,N v M, aeH e a.r eE b i yy eeR L n A, t 1 I rBs - ’ h g并与肿瘤转移有关 J rB。Eb 2诱导的细胞生存、肿 n ig n t o k: r c po h tr d me iai n i d v l p l a n ew r e e t r ee o i rz t n e eo— o瘤形成和侵袭依赖于 F K功能，可能与 F K下游 A这 A m n dcne J .E O J 2 0,1 ( 3:t9— e t acr『] MB , 0 0 9 1 )3 5 n a 31 67.信号通路有关。我们实验显示，使用阻断 Sc r阻断剂

f 1 Weto 9 s f MA, erl B, ica J e a.S Cmei h Sr s e Fnh m V

, t 1 R da —

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